细胞色素P450 2C19基因多态性对NSTE-ACS患者血小板反应性及临床预后的影响

张莹莹，郑君毅，刘婷，张莹，马静，刘寅

天津市胸科医院，天津市心血管病研究所，天津 300222

急性冠脉综合征(ACS)并发症多，病死率高，非ST段抬高急性冠脉综合征(NSTE-ACS)为其中的重要类型，其病理机制为富血小板血栓完全或部分阻塞冠脉，因此有效的抗血小板治疗尤为重要。阿司匹林联合血小板P2Y12受体拮抗剂的双联抗血小板治疗(DAPT)在心血管疾病的抗栓治疗中发挥重要作用。但氯吡格雷抵抗和治疗后血小板高反应(HTPR)不断被报道[1]。氯吡格雷抵抗患者PCI术后支架内血栓的风险性增加[2,3]，本课题前期研究也有类似发现[4]。因此如何早期识别氯吡格雷抵抗患者，降低血栓事件的发生，一直为研究的热点。许多因素被报道与氯吡格雷抵抗有关，细胞色素P450 2C19(CYP2C19)基因多态性也多次被证实与之相关[5～7]。其中CYP2C19*1等位基因是一种正常活性等位基因，即野生型，*2和*3等位基因是亚洲人群中最为常见的两种功能缺失等位基因。功能缺失等位基因携带是否与氯吡格雷抵抗甚至是HTPR相关，是否影响ACS患者的预后仍存在争议[8]。因此本研究观察了CYP2C19基因多态性对NSTE-ACS患者血小板反应性及临床预后影响。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 连续纳入2017年8～12月于天津市胸科医院住院治疗的462例NSTE-ACS患者。NSTE-ACS诊断标准符合2012年我国《非ST段抬高急性冠脉综合征诊断和治疗指南》[9]。其中男238例、女224例，年龄31～79(58.5±9.0)岁。根据CYP2C19基因型不同，分为快代谢型、中间代谢型和慢代谢型。排除标准：肝肾功能严重不良者，合并其他终末期疾病，预期寿命小于1年者；先天性心脏病、心脏瓣膜病、严重充血性心力衰竭者；已行PCI或冠脉旁路移植术者；入院前服用过氯吡格雷等抗血小板药物，或注射过普通肝素/低分子肝素等药物者；周围血管疾病或周围血管栓塞性疾病者；急性感染、免疫性疾病、脑血管疾病及肿瘤者；血液系统疾病，近期有出血倾向者和有潜在出血危险者(血小板计数<150×109/L或>450×109/L、血红蛋白<80 g/L)；应用炎症抑制药物如非甾体类抗炎药、类固醇及阿片类药物者。本研究经天津市胸科医院伦理委员会批准，所有患者知情同意。

1.2 一般资料收集 采集患者基本资料，包括性别、年龄、身高、体质量、高血压史、糖尿病史、吸烟史、饮酒史等。患者于采血前24 h口服氯吡格雷300 mg和阿司匹林300 mg，常规检测血常规[白细胞(WBC)、中性粒细胞百分比(N%)、淋巴细胞百分比(L%)、血红蛋白(Hb)、血小板(PLT)]、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、肌酐(Cr)、尿素氮、尿酸、同型半胱氨酸(Hcy)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)、肌钙蛋白I(TnI)等生化指标。

1.3 血小板活性测定 通过两种方法评价服用氯吡格雷后血小板的活性。①流式细胞术。采用流式细胞仪(Beckman Cytomics FC500 MCL，美国)、VASP检测试剂盒(PLT VASP/P2Y12,BIOCYTEX,法国)，于48 h内按说明书对标本进行操作完成检测。测定血小板血管扩张刺激磷酸蛋白(VASP)磷酸化水平，计算血小板反应指数(PRI)。②光比浊法血小板聚集试验(LTA)。采用血小板聚集仪(CHRONO-LOG Whole-Blood Aggregometer,美国)、ADP(CHRONO-PAR ADP,美国)，按说明书操作，计算血小板聚集率(PAG)。实验重复3次，取平均值。

1.4 CYP2C19基因型鉴定 采用Genomic DNA Purification Kit(Promega)试剂盒按说明书提取人基因组DNA。使用Primer 6引物设计软件进行引物设计，CYP2C19*2突变(m1型突变)引物序列：5′-AATTACAACCAGAGCTTGGC-3′，5′-TATCACTTTCCATAAAAGCAAG-3′。CYP2C19*3突变(m2型突变)，引物序列：5′- TGTGCTCCCTGCAATGTGAT-3′，5′-TTTGGGGCTGTCACCAAAGT-3′。PCR产物分别用相应的限制性内切酶QuickCut SmaⅠ(TaKaRa)、QuickCut BamHⅠ(TaKaRa)消化酶切。酶切后的产物分别进行琼脂糖凝胶电泳和限制性片段长度多态性分析。突变型因失去限制性内切酶的酶切位点，不能被酶切，因此产生的条带数不同，不含有功能缺失等位基因为快代谢型(CYP2C19*1/*1)、包含1个功能缺失等位基因为中间代谢型(CYP2C19*1/*2、CYP2C19*1/*3)，包含2个功能缺失等位基因为慢代谢型(CYP2C19*2/*2、CYP2C19*2/*3)。

1.5 随访 全部患者于PCI术后1、3、6、12、18、24月进行电话或门诊随访，再发心绞痛或急性心梗患者进行冠脉造影复查。以全因死亡、支架内再狭窄、急性PCI内血栓形成、再发急性心肌梗死定义为主要不良心血管事件(MACE)。

2 结果

快代谢型158例、中间代谢型246例、慢代谢型58例。

2.1 CYP2C19不同基因型一般资料比较 见表1。

表1 CYP2C19不同基因型一般资料比较

2.2 CYP2C19不同基因型血小板活性比较 快代谢型、中间代谢型、慢代谢型PRI分别为48.6±10.5、56.7±12.6、65.3±11.4，PAG分别为67.4±8.5、71.9±8.2、78.4±6.1，三者两两比较P均<0.01。

2.3 CYP2C19不同基因型临床预后比较 462例NSTE-ACS患者均按要求完成随访，53例(11.5%)患者发生复合终点事件，其中死亡3例(0.6%)，急性心梗再入院8例(1.7%)，经冠脉造影复查发现支架内再狭窄(狭窄程度>50%)42例(9.1%)。快代谢型、中间代谢型、慢代谢型MACE发生率分别为2.5%、9.8%、43.1%，三者两两比较P均<0.01。通过Cox回归模型对MACE进行生存分析，发生MACE定义为状态变量(发生MACE事件赋值为1，未发生者赋值为0)，基因型、PRI、PAG、性别、年龄、糖尿病史、吸烟史、饮酒史为协变量(快代谢型赋值为3、中间代谢型赋值为2、慢代谢型赋值为1；男性、糖尿病、吸烟、饮酒赋值为1；女性、无糖尿病、不吸烟、不饮酒赋值为0)，同时代入复合终点事件发生的时间，结果显示PRI(HR：1.05,95%CI：1.03～1.07，P<0.01)和基因型(HR：1.84，95%CI：1.09～3.12，P=0.02)为MACE的独立预测因子(见表2)。

表2 NSTE-ACS患者发生MACE的Cox回归分析

3 讨论

抗血小板药物氯吡格雷为无活性的前体药物，需经过肝脏细胞色素P450酶代谢转化后才能发挥抗血小板活性，而CYP2C19为其中的限速酶，CYP2C19基因突变损失代谢活性，势必影响氯吡格雷的体内激活。大量观察性研究表明，CYP2C19功能缺失等位基因携带与缺血性心血管事件增加有关[2,3,10]。因此本研究根据功能缺失等位基因携带的多少将患者分组，入组患者为接受PCI治疗的NSTE-ACS患者。其中CYP2C19*1等位基因最为普遍，是一种正常的活性等位基因，即野生型。CYP2C19*2～*8等位基因为功能缺失等位基因，为突变型。其中CYP2C19*2是最常见的功能缺失等位基因[11]。在东亚人群中，*2和*3的频率远高于欧洲和非洲血统人群[12]，据报道，*2的等位基因频率在白种人和非洲人中约为15%，在亚洲人中为25%～35%[12～14]。*3～*8等位基因在欧洲和非洲血统人群中频率较低(低于1%)。CYP2C19*3等位基因在东亚人群中较为常见(5%～15%)，考虑到该基因多态性的民族、种族差异，本研究检测了在亚洲人群中最为常见的两种CYP2C19功能缺失等位基因进行研究。结果显示慢代谢型PRI及PAG均高于快代谢型、中间代谢型，差异有统计学意义，显示CYP2C19基因型与氯吡格雷抵抗及HTPR相关。另一项相关研究报道，CYP2C19功能缺失等位基因的携带者与非携带者相比，氯吡格雷活性代谢物的形成减少了32.4%，血小板聚集率绝对值下降减少了9%(相对值减少约25%)[15]。这项研究的结论间接为本研究提供了合理的解释。另有研究报道,CYP2C19功能缺失等位基因的杂合子(如*1/*2和*1/*3)对氯吡格雷的反应介于*1等位基因的纯合子和功能缺失等位基因的纯合子或复合杂合子(如*2/*2和*2/*3)之间[15～17]。与本研究结果类似，即携带功能缺失等位基因越多，激活氯吡格雷的能力也越差，PRI或PAG也相应的增高。

一项荟萃分析纳入9 865例接受氯吡格雷治疗的患者(54.5%为ACS、91.3%为PCI)，发现即使携带一个CYP2C19功能缺失等位基因也会导致不良的预后，尤其是支架内血栓形成[6]。本研究全部纳入接受PCI治疗NSTE-ACS患者，Cox回归分析显示CYP2C19基因型与患者不良心血管预后独立相关，与以上研究结果类似。当然仍有相当的研究并未得到一致性的结论。另一项荟萃分析共纳入32项研究42 016例低风险患者(如冠心病稳定患者、ACS内科治疗患者或房颤患者)，结果显示携带一个或更多CYP2C19等位基因与不良结果之间没有显著相关性[8]。这些相互矛盾的结果可能归因于患者的基线特征不同，一组为高风险患者，另一组为低风险患者。考虑到人群的差异可能对结论的影响，本课题纳入的人群均为高危人群(NSTE-ACS患者并接受PCI治疗)。一项关于CYP2C19基因分型的荟萃分析[18](包括对36 076例参与者的24项研究)得出了一个有趣的结果，该研究根据使用氯吡格雷的适应证和种族(如是否PCI，亚洲还是欧洲人)具体分析，显示CYP2C19功能缺失等位基因的存在仅在因PCI适应证而使用氯吡格雷的患者中与不良结果相关。在白人患者中，这一关联微弱(RR：1.20,95%CI：1.10～1.31)，而在亚洲患者中，这一关联更为强烈(RR：1.91,95%CI：1.61～2.27)，这一结果与本研究结论相似。本研究显示CYP2C19基因型预测MACE的HR为1.84(95%CI:1.09～3.12)。因此，CYP2C19功能缺失等位基因在临床上主要在高危亚群(如PCI或ACS)具有重要意义，而在慢性稳定性心绞痛患者或有房颤等其他适应证的患者中，其基因型差异与不良事件的关系似乎不显著[19～21]。

可见，CYP2C19功能缺失等位基因与HTPR和氯吡格雷抵抗相关，并增加不良心血管事件的风险，慢代谢型可作为NSTE-ACS患者预后不良的预测指标，但由于入组人群的限制，缺乏低危的慢性稳定性心绞痛患者或有其他适应证患者的研究数据。因此，在临床研究中对高风险(ACS、PCI)患者，更应关注其CYP2C19基因型及血小板功能，早期锁定氯吡格雷抵抗患者，尽早干预，预防不良心血管事件的发生。对于快代谢型患者,更换新型P2Y12受体拮抗剂可能是更好的选择，但新型P2Y12受体拮抗剂的应用是否能进一步降低快代谢型患者PRI及缺血并发症仍有待进一步研究。