蛹虫草多糖灌胃对氟尿嘧啶处理大鼠骨髓功能的影响

李俊平，张爱武，张芳

内蒙古医科大学附属医院，呼和浩特 010059

氟尿嘧啶(5-FU)作为临床常用抗癌药，对胃癌、结直肠癌、乳腺癌等有很好的疗效。但5-FU会引起较强的不良反应，其中免疫损伤以及骨髓造血功能抑制最为常见，主要表现为免疫功能降低、外周血细胞数量减少。因此，尽可能减少5-FU带来的不良反应已成为当前研究的热点[1]。蛹虫草又名北冬虫夏草，属虫草菌属，与名贵药材冬虫夏草是同属异种。蛹虫草含有多种生物活性成分，包括虫草多糖、多肽、虫草酸、虫草素等，其药用和保健价值广泛，可发挥降糖、调脂、保肝、护肾、抗肿瘤等功效[2～4]。虫草多糖作为蛹虫草的活性成分之一，具有免疫调节和抗肿瘤活性的作用[5]。然而蛹虫草多糖对5-FU引起的骨髓损伤的影响还不明确。因此，本研究使用5-FU处理大鼠，使用蛹虫草多糖对其进行保护性干预，评估该药对5-FU处理大鼠骨髓功能的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 蛹虫草菌种由内蒙古医科大学药学院制药工程实验室提供。马铃薯葡萄糖培养基：200 g马铃薯切成1 cm3小块，加水沸煮30 min，8层纱布过滤，加入20 g葡萄糖，定容至1 000 mL，121 ℃灭菌30 min。Wistar大鼠40只，雄性，体质量(210±10)g，购自内蒙古医科大学动物实验中心。5-FU注射液(规格：0.25 g×10 mL)购自上海旭东海普药业有限公司；人IFN-γ ELISA试剂盒、人IL-4 ELISA试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。CFX96荧光定量PCR仪购自美国Bio-Rad；Multiskan FC酶标仪购自美国Thermo；7020全自动生化分析仪购自日本HITACHI。

1.2 蛹虫草多糖的制备

1.2.1 菌种培养 采用液体发酵培养法。取蛹虫草斜面1支，将菌丝体刮入50 mL液体发酵培养基中，25 ℃、200 r/min摇床培养7 d得到种子培养液，以10%的接种量接种至500 mL液体发酵培养基中，25 ℃、200 r/min摇床培养7 d得到发酵液，镜检观察菌体。

1.2.2 蛹虫草多糖的提取 发酵液过滤得到菌丝体，冻干机冻干，微粉粉碎机粉碎破壁。蛹虫草多糖的提取采用水溶醇沉法。取蛹虫草细粉100 g，加入1 L纯水混匀，40 kHz超声提取30 min。80 ℃加热回流1 h，趁热过滤，滤液用旋转蒸发仪浓缩至200 mL。搅拌下加入2 L乙醇沉淀多糖，静置30 min，过滤，乙醇洗涤沉淀。加适量水全溶沉淀，加4倍量乙醇再沉淀，过滤，乙醇洗涤沉淀。60 ℃烘干，得到蛹虫草多糖粗品5.62 g，得率为5.62%。

1.2.3 蛹虫草多糖的精制 ①蛋白质的去除。使用Sevag法去除蛋白质。氯仿和正丁醇按5∶1的比例混匀配制Sevag液，粗多糖浓缩液与Sevag液按4∶1的体积混合，剧烈震荡30 s后离心，取上清液，反复用Sevag液处理5次，收集上清液。②DEAE-52分离。使用DEAE-52装柱，多糖上样，依次用0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L的NaCl溶液洗脱，各洗脱150 mL，流速0.5 mL/min。收集洗脱液，每管5 mL，苯酚—硫酸法490 nm下检测洗脱液OD值。只有水洗脱出峰，其余NaCl溶液均未洗脱出峰。水洗脱得到一个主峰，合并主峰洗脱液，旋蒸浓缩。另有少量杂峰，由于含量较低，不做收集。③Sephadex G-100分离。使用Sephadex G-100装柱，将DEAE-52分离出的多糖上样，水洗脱，流速0.5 mL/min，收集洗脱液，每管5 mL，苯酚—硫酸法检测洗脱液OD值，得到一个主峰，合并主峰洗脱液，旋蒸浓缩，得到多糖纯品，其余杂峰不做处理。④HPLC法检测。使用HPLC法检测Sephadex G-100分离得到的多糖纯品。流动相为5%的甲醇水溶液，流速1 mL/min，示差折光检测器检测，得到一个对称单一峰，保留时间10.03 min。

1.3 动物分组与给药 将40只雄性Wistar大鼠随机分为4组，分别为对照组、模型组、蛹虫草多糖低剂量组、蛹虫草多糖高剂量组，每组10只。除对照组外，其余各组腹腔注射15 mg/(kg·d)的5-FU溶液，对照组给予同等体积的生理盐水，1次/d，连续给药6 d。造模结束后，蛹虫草多糖低、高剂量组分别给予20、60 mg/kg的蛹虫草多糖粗品灌胃，3次/d，连续给药3周，其余组给予同等体积的生理盐水。

1.4 观察指标

1.4.1 大鼠一般情况观察 在给药的第0、3、6、9、12、15、18、21天测定并观察大鼠体质量、毛发、腹泻的发生等情况。

1.4.2 外周血细胞数量检测 给药完成后，取血，处死大鼠。将大鼠血液保存于含有抗凝剂的采血管内，采用全自动血细胞分析仪检测外周血红细胞(RBC)、白细胞(WBC)、血小板(PLT)、血红蛋白(Hb)。

1.4.3 外周血IFN-γ、IL-4水平测定 取大鼠全血，10 000 r/min离心20 min，取上层血清，ELISA法测定血清IFN-γ和IL-4。以IFN-γ/IL-4代表Th1/Th2。

1.4.4 骨髓DNA含量测定 取大鼠股骨，用0.005 mol/L CaCl2冲洗骨髓至离心管中，4 ℃放置30 min，1 000 r/min离心15 min，弃上清。用0.2 mol/L HClO4悬浮沉淀，震荡混匀，90 ℃水浴15 min，冷却。2 000 r/min离心10 min，保留上清，以0.2 mol/L HClO4为空白。酶标仪于268 nm波长处测定OD值，DNA含量=OD值×稀释倍数。

2 结果

2.1 各组一般情况观察结果 与对照组相比，模型组大鼠毛发有脱落现象，出现集体腹泻，且体质量下降。与模型组相比，蛹虫草多糖低剂量组和高剂量组大鼠体质量有所改善，但由于大鼠间个体差异较大，组间比较并未表现出差异，毛发脱落现象也无明显改善。各组体质量比较见表1。

表1 各组体质量比较

2.2 各组外周血细胞含量比较 结果见表2。

2.3 各组血清IFN-γ、IL-4水平比较 结果见表3。

表2 各组外周血细胞含量比较

表3 各组血清IFN-γ、IL-4水平比较

2.4 各组骨髓DNA含量比较 对照组、模型组、蛹虫草多糖低剂量组、蛹虫草多糖高剂量组骨髓DNA含量分别为7.08±0.86、2.58±0.47、4.65±0.97、5.84±0.73，模型组较对照组低(P<0.01)，蛹虫草多糖低剂量组、蛹虫草多糖高剂量组较模型组高(P<0.05或<0.01)。

3 讨论

由放化疗所导致的免疫抑制以及骨髓损伤是肿瘤治疗过程中难以避免的严重副作用。骨髓是人体重要的免疫和造血器官，由骨髓产生的造血干细胞可分化成红细胞、白细胞、血小板、淋巴细胞等发挥生物学功能，使用化疗药物后，骨髓受损，造成血细胞数量和免疫功能的降低。Th1/Th2是反映机体免疫功能的重要指标。Th1和Th2细胞由辅助T细胞产生，正常情况下Th1和Th2细胞处于动态平衡中，且两种细胞相互抑制。当机体免疫功能受到抑制时，Th2占据优势，Th1/Th2比值降低，相反，其比值越高，免疫应答水平越显著[6,7]。Th1表达IFN-γ，IFN-γ能刺激B细胞，介导体液免疫，产生抗体；Th2表达IL-4，IL-4属于抑炎因子，能够抑制炎症的发生。Th1/Th2的平衡是机体免疫平衡的重要标志[8,9]。骨髓DNA含量是造血干细胞数量的体现。DNA是遗传信息的载体，细胞中的DNA会在损伤因素的作用下断裂，断裂的DNA则会进一步降解，细胞中DNA含量的减少会导致细胞增殖减缓[10]。因此，骨髓DNA含量的降低会造成骨髓造血干细胞数量的减少。本研究检测大鼠外周血细胞含量、Th1/Th2、骨髓DNA含量，观察了蛹虫草多糖灌胃对5-FU处理大鼠骨髓功能的影响。

基于中医的辨证施治理论，对于免疫损伤的治疗采取补气、补血、健脾、补肾类药物[11～14]。虫草属包括冬虫夏草、蛹虫草、秦山蛹虫草、香棒虫草、蒙山虫草等在内的多种真菌，具有相似的化学成分[15,16]。其中以传统中药冬虫夏草研究最多，大量的研究表明，冬虫夏草的多糖组分具有调节机体免疫功能、抗肿瘤、抗氧化等功效，然而价格昂贵，限制其广泛应用[17,18]。蛹虫草价格低廉、易培养，已被认为是冬虫夏草的替代品[4]。研究表明，蛹虫草多糖可提高小鼠的免疫力和抗氧化能力[19]，并能增强巨噬细胞RAW246.7的吞噬功能[20,21]。本研究前期通过水溶醇沉法获得蛹虫草多糖粗品，得率为5.62%，使用DEAE-52和Sephadex G-100进一步对粗品进行提纯，获得蛹虫草多糖纯品用于后续实验。本研究大鼠腹腔注射5-FU建立模型，给予蛹虫草多糖灌胃干预，结果显示，与对照组相比，模型组大鼠外周血RBC、WBC、PLT、Hb减少，骨髓DNA含量减少，Th1/Th2明显降低；与模型组相比，蛹虫草多糖高剂量组大鼠外周血RBC、WBC、PLT、Hb增加，骨髓DNA含量增加，Th1/Th2升高。表明蛹虫草多糖能够有效缓解由5-FU所致的大鼠骨髓功能损伤。

综上可见，蛹虫草多糖灌胃可改善5-FU处理大鼠骨髓功能，但该药能否用于减轻临床化疗药物带来的毒性反应还有待进一步研究。