中国海南坡垒炭疽病病原鉴定

谭祥丰,刘君昂,周国英*

1.中南林业科技大学,湖南 长沙 410004

2.南方人工林病虫害防控国家林业和草原局重点实验室,湖南 长沙 410004

3.森林有害生物防控湖南省重点实验室,湖南 长沙 410004

4.经济林培育与保护教育部重点实验室,湖南 长沙 410004

海南坡垒（Hopea hainanensisMerr.et Chun）是中国海南省热带雨林中生长的代表性乡土珍贵树种，是人们生产生活重要的木材来源。坡垒树通常生长在滨水区和沟渠中，高度可达20～30 m[1]。这种树在温暖潮湿的环境中长势更好，树冠枝层最为茂密[2]。近年来，人们对海南省热带珍贵树种的研究更为细致深入，并深入研究了其他龙脑香科植物的地理分布和生长范围[3,4]。集中的坡垒种植区通常会发现有大量幼苗[5]，而幼苗的生长与环境的湿度、温度及林层高度等相关因素密切相关[6]。

坡垒又是一类比较特殊的热带树木[7]，并且在与之同一科属的相关树种开发和利用中显示出巨大的潜力[8]。坡垒是一种常绿乔木，会开花，其花颜色鲜艳极其吸引人，因此被视为是观赏树木。海南热带雨林中，野生的坡垒树相对较少。相关研究数据表明，在海南只发现了几百棵野生环境中生长的坡垒树[9]。虽然野生型坡垒非常罕见，但却非常经久耐用，在当地适合做渔轮的外龙骨，亦可作码头桩材、桥梁和其它建筑用材等。此外，野生坡垒不太容易受一般虫害的影响。这些因素使坡垒成为许多处于热带和亚热带国家极受欢迎的建筑用材因此，已对坡垒树种实施具体保护[3]。虽然海南坡垒通常不存在严重虫害，但还是存在着有几种病害（例如，褐色叶斑病和叶尖枯萎病）会危害海南坡垒的叶片。这些病害发生在大面积坡垒种植区，可能会造成重大经济损失。

本研究目标是确定在中国海南澄迈林场观察到的炭疽病的病原体。迄今为止，尚未发现有关中国海南坡垒的炭疽病的报告。

1 材料与方法

1.1 材料

病害样本：新鲜的坡垒炭疽病病叶（三片，编号分别为PLCM010-1，PLCM010-2，PLCM010-3）和健康的坡垒嫩叶。采集点：海南科大林业有限公司基地。

1.2 病原菌分离与纯化

使用灭过菌的不锈钢手术刀在超净工作台上切取病叶上病斑与健康组织交界处部分[10]，用75%乙醇对样品表面进行消毒并用无菌水漂洗3 次后，置于马铃薯-葡萄糖-琼脂（PDA）培养皿，并在25 ℃恒温培养箱中避光培养7 d，筛选出待纯化菌株。然后再将待纯化的菌株转移至新的PDA，恢复菌丝生长进而产生纯培养物。

1.3 分离菌株形态学鉴定与分子生物学鉴定

将菌株PLCM010 置于25 ℃恒温培养箱培养适宜的时间，待其产孢后，根据常规形态特征将研究中收集的真菌分离株进行初步鉴定[11]，观察其病原菌菌落、菌丝及分生孢子的形态特征。使用真菌DNA 提取试剂盒，从这些纯培养的PDA 平板中提取真菌基因组DNA，从而进一步鉴定病原菌。然后，用合适的引物对分别为internal transcribed spacer[12](ITS：ITS4/ITS5)，partial sequence of glyceraldeyde-3-phosphate dehydrogenase-like gene[13](GAPDH：GDF1/GDR1)，actin gene[14](ACT：ACT-512F/ACT-783R),and beta-tubulin gene[15,16](TUB2：TUB2-T1/Bt-2b)进行PCR 扩增。之后将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳（110 V，40 min），回收目的条带，送至擎科新业生物技术有限公司测序。使用NCBI BLAST 软件（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）[17]比较测得序列与GenBank 数据库序列。下一步，根据最大简约法[18,19]使用MEGA7 软件进行系统发育分析

1.4 致病性测定

将分离纯化后的菌株培养7 d 后接种到健康的离体坡垒嫩叶上，再将接种后的离体坡垒嫩叶置于25 ℃恒温箱中保湿培养5～7 d 后，观察。

2 结果与分析

自然生长7 d 后的培养基表面菌落平均直径为7.4～7.6 cm。分生孢子为单胞，整体呈现圆柱状，两端无色且钝圆。在菌落上所观察到的菌丝看起来极其致密，表面蓬松，中心呈灰色，边缘呈白色，背面呈白色至深灰色[20]（图1）。其中：a) 一株受感染的坡垒植物。b) 侵染炭疽病的叶片。c)PDA培养皿上的菌落。d)分生孢子，比例尺=50 μm。e) 附着胞，比例尺=10 μm。

图1 炭疽病Fig.1 Anthracnose disease

测序后的序列上传到GenBank 数据库，序列号分别为MN841836、MT439332、MT439334 和MT439333，炭疽病侵染早期通常表现为灰色病变[20]，就该分析而言，大于50%的MP 自举支持值均显示在最终的系统发育树中。将Monilochaetes infuscans作为该分析的外群，并使用最大似然法进行这项基于ITS、GAPDH、ACT和TUB2基因序列进行组合矩阵分析，生成果生炭疽菌MP 系统发育树。大于50%的MP 自举支持值均显示在此系统发育树中，结果图2 所示，比例尺=20 nucleotide substitutions。本研究中的分离株用黑色菱形标记。从图2 可以看出分离纯化得到的菌株与ICMP 18646和ICMP 18581 集中于系统发育树的一枝[21]。

图2 比较果生炭疽菌与其他炭疽菌属种类之间的进化关系的系统发育树Fig.2 A phylogenetic tree comparing the evolutionary relationships between Colletotrichum fructicola and other Colletotrichum species

通过使用菌饼和分生孢子悬浮液（105个/mL）分别接种在新鲜坡垒嫩叶的有伤和无伤部分，同时用无菌水进行对照实验，证实了这种病原菌的致病性[18]。重复五次此项实验，并将叶片在潮湿的25 ℃腔室内培养7 d。图3 结果显示此后这些叶片的接种侧的暗褐色病变较为明显，而对照区域未出现这种病变，因此符合Koch 原则的假设。另外，还从这些叶片的接种部分再次分离果生炭疽菌，发现其形态与最初分离株的形态相同。

图3 致病性测定结果Fig.3 Results >of back experiment

3 结论

本研究中坡垒病叶上观察到的病征与由果生刺盘孢炭疽菌引起的油茶炭疽病症状相似。再基于上述分析，根据其分子和形态特征，确定引起影响坡垒树的炭疽病的致病性真菌为果生刺盘孢炭疽菌（Colletotrichum fructicola）[22]。据我们所知，这是第一份描述影响中国坡垒树的炭疽病由果生炭疽菌引起的案例报告。