皱皮木瓜种质药用成分含量及性状变异研究

马凯旋,沈汝波,丰 震,任红剑,孔 青,于 晓,刘国兴,王 利**

1.山东农业大学黄河下游森林培育国家林业与草原局重点实验室,山东 泰安 271018

2.山东临朐县果树站,山东 临朐 262600

3.山东宁阳县林业局,山东 宁阳 271400

4.山东医药技师学院泰山食品药品检测中心,山东 泰安 271016

我国是皱皮木瓜（Chaenomeles speciosa）的起源分布中心，主要分布于安徽、山东、湖北、贵州、四川、重庆等地[1]。皱皮木瓜为蔷薇科落叶灌木，枝具刺，花簇生，其适生于温带、亚热带气候区，适应性强，微酸、微碱性土壤均能适应[2]。其果实干燥后果皮皱缩，临床用以治疗吐泻转筋、湿痹、脚气、水肿、痢疾及维生素C 缺乏症等疾病[3]，具有保肝、驱风除湿、舒筋活络、抗炎镇痛、消肿等功效，它是保健食品和中药的重要来源[4]。前人研究表明矿质元素参与植物有机体代谢和调节机体酶活性，是果实生长发育、产量形成和品质提高的物质基础[5]。

皱皮木瓜具有丰富的药用、营养价值，齐墩果酸和熊果酸是皱皮木瓜的主要药效成分[6]，两者对木瓜资源的开发具有特别重要的意义。结合皱皮木瓜中微量元素的含量，探究其之间的相关性，对指导皱皮木瓜提高药用价值具有重要的理论价值和实践意义。目前关于皱皮木瓜中齐墩果酸、熊果酸与微量元素之间的相关性分析鲜见报道。本文以山东临沂14 株不同单株的皱皮木瓜为试材，测定其果实齐墩果酸、熊果酸含量以及钙、镁、锌等6 种微量元素的含量，分析齐墩果酸、熊果酸和微量元素之间相关关系，为药用皱皮木瓜种质资源育种与栽培提供理论基础和技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料14 株皱皮木瓜采自于山东省临沂市木瓜药材基地，其树龄均为8 年。取其果实自然风干后放入55 ℃恒温烘箱烘干，粉碎后过筛备用。

1.2 仪器与试剂

Agilent 1260 高效液相色谱仪，KB-500DB 型数控超声波清洗器，电子天平（型号BT125D），电子天平（ME204），高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪有限公司），TAS-990 型原子吸收分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；Zn、Fe、Mn、Cu、Ca、Mg 空心阴极灯(北京普析通用仪器有限责任公司)；对照品齐墩果酸（0709-9803）来源于中国药品生物制品检定所，对照品熊果酸（110742-201421）来源于中国食品药品检定研究院，其纯度均大于93.8%。

1.3 齐墩果酸及熊果酸提取及含量测定

1.3.1 色谱条件 在齐红[7]等人的试验方法上进行了改进，采用超声提取，HPLC 测定。色谱柱Waters Symmetry C18(250 mm×4.6 mm，5 μm) SN：02863428 013841；流动相：甲醇-水-冰醋酸-三乙胺（265：5：0.1：0.05）；流速：1.0 mL/min；检测波长：210 nm；柱温：18 ℃；进样量20 μL。

1.3.2 对照品溶液的制备 精密称取齐墩果酸对照品、熊果酸对照品0.01179 g、0.02023 g 分别置10 mL棕色量瓶中，加甲醇制成1.179 mg/mL 齐墩果酸的对照品溶液和含1.898 mg 熊果酸的对照品溶液。分别精密量取齐墩果酸对照液1 mL、熊果酸对照液0.5 mL 置于10 mL 棕色量瓶中，加甲醇制成mL各含0.1179 mg/mL、0.0949 mg/mL 的混合液1。分别精密量取齐墩果酸对照液1 mL、熊果酸对照液0.5 mL 置于50 mL 棕色量瓶中，加甲醇制成0.02358 mg/mL、0.01898 mg/mL 的混合液2。

1.3.3 供试品溶液的制备 取本品细粉约0.4 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）20 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

1.3.4 峰面积计算 齐墩果酸、熊果酸含量均由标准品的峰面积计算得出，其计算公式为：

AX：供试品峰面积；CX：供试品浓度；AR：对照品峰面积；CR：对照品浓度。

1.4 微量元素提取及含量测定

1.4.1 样品处理 利用火焰原子吸收法测定Zn、Fe、Mn、Cu、Ca、Mg 六种微量元素含量[8]。准确称取皱皮木瓜粉末0.1 g，置于100 mL 的消化管中，先用水润湿样品，然后加5 mL 浓硫酸，轻轻摇匀、放置过夜，在消化炉上先低温缓缓加热，当溶液全部呈棕黑色时，从消化炉上取下消化管，稍冷，逐滴加入300 g/L H2O210 滴，并不断摇动消化管使其充分反应。加热至微沸10～20 min，再加入H2O25～10 滴。如此反复2～3 次，直至消煮液呈无色或清亮色后，再加热5～10 min，已除尽过剩的双氧水。取出消煮管冷却，用定性滤纸过滤到15 mL 离心管中并定容，供待测。

1.4.2 标准曲线（见表1）

1.5 数据处理与分析

利用SPSS 22.0、Excel2003 软件对数据进行统计分析和作图；用方差分析比较各药用成分之间的差异；对齐墩果酸、熊果酸与微量元素之间进行相关性分析及主成分分析。

表1 六种微量元素测定时的回归方程及相关系数Table 1 Regression equations and correlation coefficients for determination of six trace elements

2 结果与分析

2.1 皱皮木瓜果实齐墩果酸、熊果酸含量的变化

测定结果表明，不同种质间的齐墩果酸的含量普遍高于熊果酸的含量。各种质间齐墩果酸的含量差异较大，变异系数为44.30%，平均值为5.220 mg·g-1，种质M13含量最高8.024 mg·g-1，M8最低1.568 mg·g-1。熊果酸含量相对差异较小，变异系数为28.67%，平均值为1.476 mg·g-1，M2种质含量最高1.987 mg·g-1，M1种质最低0.580 mg·g-1。齐墩果酸和熊果酸含量之和最高（9.822 mg·g-1）的种质是M13，最低的是M6(2.588 mg·g-1)。

表2 皱皮木瓜果实齐墩果酸、熊果酸的含量（mg·g-1）Table 2 The contents of oleanolic acid and ursolic acid in fruit of Chaenomeles speciosa

2.2 皱皮木瓜果实微量元素含量的分析

表3 皱皮木瓜种质中微量元素含量（μg·g-1）Table 3 Contents of trace elements in Chaenomeles speciosa

由表3 可见，14 个种质都含有大量人体必需的微量元素，其中Ca 元素的含量最高，远高于其它元素。Mg 元素也相对较高，Fe、Mn、Zn 次之，Cu 含量最低。Ca 元素含量最高的种质是M4，高达1606.80 μg·g-1；Mg 元素含量最高的种质是M2，含量为388.60 μg·g-1。不同种质间微量元素含量差异明显，Fe 元素的变异系数为28.26%，最高含量为230.65 μg·g-1，最低含量为93.75 μg·g-1；Zn的变异系数为27.12%，最高含量大约是最低含量的两倍。

2.3 皱皮木瓜果实的微量元素与齐墩果酸、熊果酸相关性分析

皱皮木瓜果实齐墩果酸、熊果酸与6 种微量元素之间的相关性分析结果表明(表4)，齐墩果酸的含量与Fe 元素含量呈极显著负相关，相关系数是-0.881；与Ca 元素含量成显著负相关，相关系数是-0.579；与Zn、Mn、Cu、Mg 元素含量都成负相关。熊果酸的含量与Zn 元素呈显著负相关，相关系数是-0.555；与Fe、Cu 元素成负相关，与Mn、Ca、Mg 元素成正相关；这表明通过测皱皮木瓜中这六种微量元素的含量，可推测出其中齐墩果酸、熊果酸含量的高低，为筛选优质木瓜资源提供一定的科学依据。同时6 种药用成分之间存在一定的相关性，Fe 元素与Zn 元素、Mg 元素与Ca 元素都成极显著正相关性；齐墩果酸与熊果酸之间相关性并不显著。

表4 皱皮木瓜果实的微量元素与齐墩果酸、熊果酸的相关性Table 4 Correlations between trace elements and oleanolic acid,ursolic acid in fruit of Chaenomeles speciosa

2.4 皱皮木瓜种质性状变异的主成分分析

皱皮木瓜种源药用成分变异的第1、第2 主成分和第3 主成分的贡献率分别为36.547%、27.985%和14.776%；在第1 主成分分析中Fe 元素特征值较大，为0.552，即Fe 元素占主导地位，故可以称第1 主成分为Fe 元素因子。在第2 主成分中，Ca 的特征值达到0.623，表明皱皮木瓜药用品质受Ca 元素的影响较大，故可以称第2 主成分为Ca 元素。在第1、2 主成分中，齐墩果酸的特征值也相对较高，在皱皮木瓜药用品质评价中可作为重要性状。在第2 主成分中，熊果酸特征向量较大(0.717)，故称第3 主成分是熊果酸元素(表5)。前2 个主成分累计贡献率仅为64.532%，前3 个主成分累计贡献率为79.308%，表明各性状指标的累计贡献率增长较慢，木瓜种质资源具有较大的遗传多样性。

表5 皱皮木瓜种质性状变异的主成分分析结果Table 5 Results of principal component analysis of character variation in germplasms of Chaenomeles speciosa

3 结论与讨论

皱皮木瓜果实的微量元素和药用成分变异丰富，即使来自同一环境的不同种质也存在显著变异，果实中齐墩果酸、熊果酸含量丰富[9]，二者都是其果实中重要的三萜类化合物，药理研究表明，它们具有一定的保肝作用[10]。张玲等[11]曾用HPLC 法测定了不同品种木瓜中齐墩果酸和熊果酸的含量，结果显示皱皮木瓜中齐墩果酸和熊果酸含量最高；齐红等[7]运用HPLC 转换波长法测得皱皮木瓜齐墩果酸含量范围为2.805 mg·g-1～16.445 mg·g-1，熊果酸含量范围2.514 mg·g-1～9.041 mg·g-1。他们的研究结果与本研究有所不同，这可能由于试材的基因型差异，以及与试验环境、采集时间等因素有关。

本研究揭示了皱皮木瓜中齐墩果酸、熊果酸与6 种微量元素的含量呈一定的相关性。但是有关植物间药用成分与微量元素之间相关性的研究较少，其中罗敏等人[12]对皱皮木瓜中齐墩果酸、熊果酸的含量与土壤理化性质进行了相关性分析，结果表明皱皮木瓜中熊果酸受土壤理化性质的影响最大。土壤因素等影响植物叶片、果实等品质；因此根据植物果实中药用成分或者土壤中微量元素含量，可大致推断其产量的高低[13-16]。其次在植物的同一器官中进行有关元素含量和药用成分的研究较少，该实验结果揭示了皱皮木瓜果实中微量元素和药用成分的相关性。在以后育种工作当中，可通过间接辅助育种，适当控制Fe、Zn 等微量元素的含量，以增加齐墩果酸或绿原酸等有益酸的含量；另外，因药用成分检测成本较高，操作复杂，而检测微量元素的方法和技术，简单易操作，这大大提高了选择育种的效率。

通过研究植物的主要性状，由不同品系或单株试材的各性状指标进行主成分分析，所得到的结果为该类植物种质资源评价提供重要依据[17,18]。本研究根据皱皮木瓜种质性状变异的主成分分析结果，得到影响皱皮木瓜种源药用变异情况的第1、2 主成分和第3 主成分分别是Fe 元素因子、Ca 元素因子和熊果酸因子，其研究结果对皱皮木瓜种质资源评价具有重要的意义。

皱皮木瓜作为重要的药用植物，药用成分含量丰富，尤其以种质M11和M13为代表，它们不仅齐墩果酸和熊果酸含量高，而且和其他种质相比其Ca 元素更是丰富，分别高达1050.20 μg·g-1，1108.10 μg·g-1，可作为优质药用皱皮木瓜新种质。尽管本研究阐明了不同种质间药用成分及微量元素的相关关系，对今后药用皱皮木瓜的种质选择具有重要的价值。但是，毕竟受研究时间的限制，测定的种质数量和成分种类偏少，为了更加深入了解皱皮木瓜种质间的药用成分关系，筛选出更多的优良新种质，需要结合其他试验，更加全面系统地进行研究和分析。