偏穗鹅观草(Roegneria komarovii)的分子核型

王子君，李景环，金 凤

(内蒙古师范大学生命科学与技术学院，呼和浩特 010020)

小麦族(Triticeae Dumortier)中最大的属是鹅观草属，全世界有130多种，广泛分布于北半球的温寒地带[1]，在我国有70多种，主要分布于西北、西南和华北地区[2]。鹅观草属植物多数种类是优良牧草，有些种还具有较强的抗逆性，可以作为小麦和禾本科牧草育种的重要基因资源。但是由于鹅观草属植物形态变异复杂，在与鹅观草属相似的属之间以及鹅观草属内种的划分等方面，至今仍然存在分歧[1-5]。

有关鹅观草属的分类研究报道很多，许多学者采用了染色体核型分析的方法，该方法是染色体组分析的一种比较有效的方法，指对生物的染色体数目、大小、形态和随体等特征进行分析[6-14]，因此得到了大多数分类学家和细胞遗传学家的认可。但是，普通的核型分析技术在染色体来源以及同源染色体配对方面，还存在一定的不确定性。近十几年来，染色体荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization,FISH)的发展和应用，使得该方法在物种分类、起源和进化等的研究中得到青睐[15-21]。

45 S rDNA是高度保守的重复序列。FISH技术染色体定位时，45 S rDNA 一般分布于有随体的染色体的次缢痕区域，在核型分析中对区分染色体类型是比较有用的细胞学依据[15-18]。5 S rDNA 也是高度保守的重复序列，但是它在染色体上的位置没有明显特征，是随物种不同而不同[17-20]。pAs 1 DNA一般分布在染色体末端或者着丝粒处，在不同物种中，其差异显示在pAs 1 DNA拷贝数的多少和分布位置上。这几种重复序列常被用来制备染色体荧光原位杂交的探针，从而来研究物种的起源、分类与进化。

偏穗鹅观草(Roegneriakomarovii)是禾本科(Poaceae)小麦族(Triticeae)鹅观草属(Roegneria)多年生优良牧草，在新疆、蒙古、苏联中亚和西伯利亚等地均有分布，大多数生长于海拔1 800～2 900 m处。有关偏穗鹅观草的细胞学研究未见报道。在本试验中，借助荧光原位杂交技术对偏穗鹅观草的染色体进行的5 S rDNA和45 S rDNA以及pAs 1 DNA的定位，进而相对准确地对偏穗鹅观草的染色体组进行分子核型分析，为偏穗鹅观草的遗传育种提供一定的细胞学信息，在细胞学水平上为鹅观草的分类及系统进化补充信息。

1 材料与方法

1.1 材 料

偏穗鹅观草种子由中国农业科学院草原研究所提供。分别带有5 S rDNA、45 S rDNA和pAs 1 DNA的质粒由南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室提供。

图1 偏穗鹅观草染色体5 S rDNA定位的中期染色体形态图和核型图

图2 偏穗鹅观草染色体45 S rDNA定位的中期染色体形态图和核型图

1.2 方 法

1.2.1偏穗鹅观草染色体标本的制备

1) 材料培养及处理。

在加水的培养皿中放置数粒饱满的偏穗鹅观草种子，置于25 ℃的培养箱内萌发，当根尖长度为1.5～2 cm时，将根尖剪下经过预处理、固定、解离、软化、染色和压片等过程，制备染色体玻片。

2) 冰冻揭片。

选择染色体分散较好的玻片放入-20 ℃冰箱中储存24 h后揭片脱水，将玻片放在无水乙醇中20～30 min后取出在室温下晾干备用。

1.2.2探针的标记

通过DNA切口平移法，用地高辛-dUTP标记5 S rDNA探针和pAs 1 DNA探针，用生物素-dUTP标记45 S rDNA探针。

1.2.3原位杂交与图片采集

原位杂交参照李景环等[16]和裴自友等[18]的方法进行。

采用日本产OLYMPUS-BX 53荧光显微成像系统100倍油镜下对染色体分散好的细胞进行图像采集。

1.2.4核型分析

采用Karyo 3.1软件对染色体进行长度测量，结合荧光标记特征对染色体进行配对。选择5个染色体分散好的细胞，测量染色体的短臂(p)长度，长臂(q)长度以及总长度，每条染色体测量3次取平均值，计算每一对染色体短臂(p)长度，长臂(q)长度以及总长度的平均值，得出染色体的绝对长度、相对长度和臂比。用Excel软件分析制作染色体核型模式图。

2 结果与分析

2.1 染色体数目的确定

通过对偏穗鹅观草分散良好且结构清晰的中期染色体进行镜检观察，选择30个细胞进行染色体计数，以85%以上细胞的染色体数确定为偏穗鹅观草的染色体数目2 n=28。

2.2 染色体核型特征

利用Karyo 3.1软件进行染色体长度测量和同源染色体配对。日本产OLYMPUS-BX 53荧光显微成像系统拍摄的染色体图及核型图见图1、图2、图4，对图1和图2进行合并得到图3。

图3 偏穗鹅观草染色体5 S rDNA和45 S rDNA定位的中期染色体形态图和核型图

图4 偏穗鹅观草染色体pAs 1 DNA定位的中期染色体形态图和核型图

由核型图(图1、图2和图4)可以看出，在配对的染色体中，中部着丝粒(m)类型的染色体有13对，近中部着丝粒(sm)类型的染色体有1对，其中m类型染色体中第6号短臂、第14号染色体长臂具随体。

2.3 5 S rDNA、45 S rDNA和pAs 1 DNA在染色体上的定位

从图1到图4可看出，在荧光显微镜下，被DAPI(4,6-二氨基-2-苯基吲哚)复染后，染色体呈现蓝色荧光；被地高辛-dUTP标记的5 S rDNA和pAs 1 DNA应该呈现出红色荧光，但与背景染色体的蓝色组合后，红色变淡，呈现出粉红色荧光；生物素-dUTP标记的45 S rDNA应该呈现的绿色荧光，同样与背景染色体的蓝色组合后呈现出亮绿色荧光。结果显示，5 S rDNA在2对染色体上有杂交信号，分别位于第6对染色体的短臂上和第11对染色体的长臂上(图1)；有2对染色体检测到45 S rDNA杂交信号，分别位于第6对染色体的短臂上和第14对染色体的短臂上(图2)；有8对染色体检测到明显的pAs 1 DNA的荧光信号，4对染色体表现出较弱的pAs 1 DNA荧光信号，有2对染色体(第8对染色体、第13对染色体)未检测出荧光信号(图4)；5 S rDNA和45 S rDNA的双色杂交定位中，可以看出在第6对染色体的短臂上同时出现了5 S rDNA和45 S rDNA的荧光信号。5 S rDNA在远离着丝粒端，45 S rDNA在近着丝粒处，但是5 S rDNA和45 S rDNA紧密连锁。

2.4 偏穗鹅观草染色体核型参数

用Excel软件对染色体相对长度和臂比进行计算，得到偏穗鹅观草中期染色体核型参数表和核型模式图(表1和图5)。

图5 偏穗鹅观草染色体核型模式图

表1 偏穗鹅观草染色体核型参数

由表1可知，偏穗鹅观草的体细胞染色体数为2 n=28，染色体组总长度为104.785μm，染色体的绝对长度变异范围是10.806～5.323μm，平均绝对长度为7.485μm，相对长度范围为10.313 %～5.079%，最长染色体与最短染色体长度比为2.030，偏穗鹅观草染色体核型公式为2 n=4 x=28=26 m(4 SAT)+2 sm。

3 讨论与结论

3.1 偏穗鹅观草核型

本研究表明，偏穗鹅观草染色体数为2 n=28，有2对具随体的染色体，随体分别位于第6号、第14号染色体的短臂上。染色体组总长度为104.785μm，染色体的绝对长度变异范围为10.806～5.323μm，平均绝对长度为7.485μm，相对长度范围为10.313%～5.079%，最长染色体与最短染色体长度比为2.030。臂比大于2∶1的染色体有0组，所占比例为0，根据这2项主要特征可以判断偏穗鹅观草的核型类型属于Stebbins核型分类中的1B型。核型不对称系数为56.01%。因而，偏穗鹅观草染色体核型公式为2 n=4 x=28=26 m(4 SAT)+2 sm。

小麦族牧草染色体基数为x=7[7]，本研究中的偏穗鹅观草染色体数为28条，为四倍体(2 n=4 x=28)，核型的构成是以中部着丝粒染色体为基础，与多数已知染色体数目的鹅观草属植物相似。

孙根楼等[2]在1992年报道的偏穗鹅观草的核型公式2 n=24 m+2 sm+2 sat，核型类型2 A，以及随体出现于第12对sm型染色体上；本研究结果与之不同。本研究认为，偏穗鹅观草的染色体虽然只有28条，但是有些染色体仅从形态大小特征来看，染色体间的特征差异不明显，如果单纯采用普通染色体制片法进行核型分析，可能会给计算染色体的核型参数带来一定程度的不确定性，因此对染色体进行核型分析时会有一定的误差，可以结合其他的方法手段辅助分类，以便减少误差。如结合特定的荧光标记，进行染色体的配对会相对更加准确，而且更具科学性。

3.2 原位杂交

荧光原位杂交实验中最重要的是有效的探针标记[13,16]。实验中，要根据荧光信号的强弱适当改变探针的使用量，使其在中期染色体上出现清晰且明亮的FISH杂交信号[13-18]。

本研究中，5 S rDNA检测到的FISH杂交信号为4个，分别位于第6对染色体的短臂上和第11对染色体的长臂上，第6对染色体上的荧光信号比较强，第11对染色体上的荧光信号比较微弱；45 S rDNA 在偏穗鹅观草染色体上检测到了6个荧光信号，其中4个清晰且明亮，位于第6对染色体的短臂上和第14对染色体的短臂的端部，2个比较弱的荧光信号，位于第5对染色体的短臂的端部；5 S rDNA和45 S rDNA的双色荧光原位杂交技术结果显示，5 S rDNA和45 S rDNA的杂交信号强弱不同，在第6对染色体的短臂上同时出现了5 S rDNA和45 S rDNA的荧光信号，5 S rDNA在远离着丝粒处，45 S rDNA在近着丝粒处，但是二者间距较短，其余5 S rDNA和45 S rDNA的杂交信号则位于不同染色体上，利用5 S rDNA和45 S rDNA的荧光标记，能够准确识别4对同源染色体，在不同的染色体上5 S rDNA和45 S rDNA不仅存在着量的差异，而且也存在着位置的差异，能够提高核型配对的准确率。而pAs 1 DNA的FISH杂交信号则有28个清晰明亮的点(一条染色体上可能有2个及以上的信号点)，以及一些较微弱且弥散的信号。pAs 1 DNA在偏穗鹅观草染色体上的杂交信号强弱不一，有的信号强，有的信号比较弱，是因为拷贝数越多信号相对就越强[20]。以上标记特征为染色体的同源配对提供了明确标识。

根据已检测到的 45 S rDNA、5 S rDNA以及pAs 1 DNA的FISH 杂交信号数目以及位置可以明确地区分开5对同源染色体，一定程度地提高了核型分析的准确度[19]。但是由于pAs 1 DNA有些杂交信号不明晰，而且有一些染色体上没有该标记信号，给同源配对带来了困难。想要对偏穗鹅观草进行更准确地同源配对，有待开发一些其他序列的标记，以确保染色体配对的准确性和核型分析的精确性与一致性。

3.3 结 论

本次研究确定偏穗鹅观草的染色体数目为28，为四倍体。偏穗鹅观草的核型公式为2 n=4 x=28=26 m(4 SAT)+2 sm，核型类型属于1 B型，经过计算得出其核型不对称系数为56.01%，判断偏穗鹅观草染色体属于较保守的类型。

在偏穗鹅观草中，5 S rDNA分别位于第6对染色体的短臂上和第11对染色体的长臂上；45 S rDNA分别位于第6对染色体的短臂上和第14对染色体的短臂上；有8对染色体检测到明显的pAs 1 DNA的荧光信号，大多分布于染色体的端部，少数定位于着丝粒区域。荧光原位杂交技术大大提高了染色体核型分析的可靠性，为鹅观草属植物的属内分类提供了细胞学资料[22]。