除草剂Basta对番茄再生体系的影响

岳宁波　潘鹏程　潘寅涛　闫见敏　李云洲

除草剂Basta对番茄再生体系的影响

岳宁波潘鹏程潘寅涛闫见敏李云洲

（贵州大学农学院贵州贵阳550025）

以番茄()‘GZ01’材料下胚轴为外植体，探究不同浓度Basta处理对番茄愈伤组织诱导、分化以及幼苗的影响，以期为以Bar基因作为选择标记基因的番茄转基因遗传转化奠定基础。结果表明：番茄对Basta有一定的天然本底抗性，同时，Basta对番茄愈伤组织的生长分化及叶绿素的合成具有一定的抑制作用，当Basta处理浓度小于0.5 mg·L-1时，番茄愈伤组织可以生长分化，当Basta处理浓度大于1.0 mg·L-1时，番茄愈伤组织培养后期死亡。当选择压浓度为1.0 mg·L-1，最宜作为番茄遗传转化的标记基因。

番茄；选择压；Basta

中国是番茄种植面积最广的国家[1]，但我国每公顷番茄产量与其他番茄生产国相比却较低，造成产量低的主要原因是杂草降低了作物的产量和品质，同时增加了生产成本[2]。通过化学药剂除草是目前番茄生产中最常用的除草方式[3]，然而，杀草普广、活性高的除草剂大多缺乏选择性，在杀灭杂草的同时对作物也会产生药害[4]。培育具有除草剂抗性的作物，在降低生产成本的同时也提高了作物的安全性[5]。

Basta是一种广谱非选择性的除草剂，其有效成分是L-phosphiothricin（PPT）的铵盐，对植物的地上部和地下部分均有枯死作用。研究证明，转基因的植物能表现出对除草剂Basta的抗性[6]，由于栽培的番茄在苗期通常需要人工除草，因此，表达抗除草剂的转基因番茄可以大幅度的降低人工成本。

再生体系的优化是农杆菌介导的遗传转化番茄成功的关键[7]，而将基因作为选择标记基因，将其应用于番茄转基因研究中，不仅可以起到筛选转化子的作用，而且获得的转基因植株还具有抗除草剂的特殊功能。目前将基因作为选择标记基因应用于番茄基因工程中研究甚少，作为筛选抗性压的Basta选择压也不知，该实验研究了不同浓度Basta对番茄愈伤组织生长和分化的影响，并据此选择合适的转基因筛选压，为以基因为选择标记基因的番茄转基因技术提供前提和依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料和试剂

番茄材料“GZ01”由贵州大学农学院植物病理实验室提供。

1.2 试验方法

1.2.1 无菌苗的获得

精选健康的番茄种子用1.0 %的NaClO消毒5 min后，用无菌水冲洗3~5次，30 s/次，用灭菌的滤纸吸干后接种于1/2MS培养基于黑暗中培养，待种子发芽露白后置于光照强度240 mol·m-2·s-1的人工气候培养箱内培养（光/暗：16 h/8 h，温度：28 ℃/18 ℃（光/暗），相对湿度70 %）[1]。

1.2.2 愈伤组织的诱导及分化

选取生长10 d的无菌苗，将其子叶切割成0.5 cm2正方形小块置于诱愈培养基（MS+3.0mg·L-1 6-BA +0.1 mg·L-1 IAA）上进行培养，叶背朝下，光照培养，每10 d进行一次继代培养，待长出愈伤后，转移至分化培养基（MS+2.0mg·L-16-BA +0.2 mg·L-1IAA）上继续培养。

1.2.3 Basta处理

Basta对愈伤组织的生长影响：将GZ01 番茄4-5mm大小的胚性愈伤组织接种在附加0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg·L-1Basta的诱导培养基上，称其重，培养4周后，观察其生长情况，再称其重，计算其在不同Basta浓度下增重率，每一浓度3此重复，取平均值。增重率（％）=（末重-初重）∕初重×100.0 %

Basta对番茄幼苗的影响：使用0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg·L-1的Basta处理5叶期番茄幼苗一周后，检测叶绿素a和叶绿素b的含量。

2 结果与分析

2.1 Basta对愈伤组织诱导的影响

由图1可知，Basta对番茄愈伤组织的诱导有抑制作用，当所用的Basta浓度大于1 mg·L-1时，番茄愈伤组织全部变为褐色并且死亡。而对照生长正常、膨大，外植体保持绿色，愈伤组织增重率为833.0 %。处理中Basta浓度为0.5 mg·L-1、1 mg·L-1时，外植体部分死亡，部分仍然保持绿色，随着Basta浓度的增加，愈伤组织的增重率从883.0 %逐渐下降到99.3 %（见图1）。

图1　不同Basta浓度对番茄愈伤组织生长的影响

2.2 Basta对番茄幼苗的影响

由图2可知，Basta对叶绿素a和叶绿素b的合成有一定的抑制作用，随着Baste浓度的增加，叶片叶绿素a和叶绿素b都随着降低，当Baste浓度大于2.5 mg·L-1，与对照达到显著差异，抑制效果显著。

图2　不同浓度的Basta对叶绿素的影响

3 讨论与结论

转基因技术通常会涉及报告基因（也称标记基因），通过报告基因指示目的基因是否成功转入受体细胞。常用的报告基因有卡娜抗性基因（）[8]、潮霉素抗性基因（）[9]等。

该试验通过筛选出番茄愈伤组织的最佳Basta选择浓度，为番茄转基因功能验证提供研究基础，同时也为筛选耐除草剂突变体提供研究基础。该研究在实验过程中还发现Basta对不定芽生根有一定抑制作用，使得以Basta为选择压的转基因筛选变得困难，在该实验中发现可以将不定芽先在添加Basta的生根培养基上筛选10 d左右，然后再转接到不含Basta的生根培养基。这样，阴性转化子在前期筛选过程中死亡，阳性转化子继续存活，后期将存活的阳性转化子介入不含Basta的生根培养基中生根。因此，分2个阶段生根培养有助于阳性转化子的获得。并且通过实验知道Basta抑制番茄幼苗的叶绿素a和叶绿素b的合成，可以通过对番茄幼苗喷施2.5 mg·L-1Basta再次筛选耐除草剂突变体。

另外，除草剂的大规模使用，节约了大量劳动力的同时，也给土壤造成一定污染，尽管一些除草剂可以降解，但是完全降解也需要一定年限，当今土地资源极度短缺，提高土地复种指数是解决土地资源短缺的主要措施，而除草剂的残留对下一轮作物生长有一定影响。尤其在蔬菜生产中，除草剂残留对下一茬蔬菜生长影响很大。因此，在今后的研究中应该进一步研究田间除草剂残留对下一茬番茄生长产生的影响。

[1]Anonymous. FAOSTAT[EB/OL].www. faostat.fao.org.

[2]Bakht T,Khan I A. WEED CONTROL IN TOMATOMill.) THROUGH MULCHING AND HERBICIDES[J].Pakistan Journal Of Botany,2014,46(1):290-293.

[3]Mayerová M, Madaras M,Soukup J. Effect of chemical weed control on crop yields in different crop rotations in along-term field trial[J].Crop Protection,2018(114):215-222.

[4]贾小霞,刘石,齐恩芳,等.草铵膦对转基因抗草铵膦马铃薯田间杂草的防效及安全性评价[J].核农学报,2019,33(10):2040-2047

[5]邱龙,马崇烈,刘博林.耐除草剂转基因作物研究现状及发展前景[J].中国农业科学,2012,45(12):2357-2363.

[6]Lutz K A, Knapp J E, Maliga P,. Expression of bar in the plastid genome confers herbicide resistance[J].Plant physiology,2001,125(4):1585-1590.

[7]贺玺强,徐恒戬,赵汝凤.不同品种类型番茄的离体再生体系研究[J].种子,2013,32(6):11-15.

[8]Rashid A.Comparison of a kanamycin versus hygromycin resistance gene in transgenic plant selection of Arabidopsis thaliana L[J].Tissue cell,2017,1(1):1-2.

[9]Chaudhry Z,Rashid H.An improved Agrobacterium mediated transformation in tomato using hygromycin as a selective agent[J].AFRICAN JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY,2010,9(13):1882-1891.

贵州省科技计划项目(NO:黔科合平台人才[2017]5788- 28)；贵州大学人才引进科研项目(NO:贵大人基合字[2017]50号)；贵州大学实验室开放项目(NO:SYSKF2019- 55)

岳宁波(1996- )，女，贵州毕节人，硕士研究生，研究方向：蔬菜抗病育种。

闫见敏(1983- )，女，河北邯郸人，博士，副教授，研究方向：蔬菜分子植物育种；李云洲(1986- )，男，山西晋城人，博士，讲师，研究方向：蔬菜抗病育种。

S436.412

A

2095-1205(2020)05-14-02

10.3969/j.issn.2095-1205.2020.05.07