电针神门、四神聪对卵巢摘除大鼠睡眠时相及脑脊液中PGD2系统的影响*

曹 华，冯美果，侯 帅，魏科祥

(1.咸宁市中心医院，湖北 咸宁 437100； 2.西安市第一医院，陕西 西安 710002)

随着人们对生活质量要求的不断提高，女性围绝经期(perimenopausal period)的相关症状日益受到关注，其中睡眠障碍是围绝经期的主要症状之一[1]，严重危害女性的健康。目前循证医学对失眠的主要治疗方法是口服具有镇静、催眠作用的药物，以达到强制入睡的目的，但是这类药物不但改变了生理性的睡眠结构，同时还造成了一系列不良反应。中医学在治疗失眠方面具有独特的疗效，尤其是针灸治疗，配穴方法多样，临床效果显著[2-3]。

本研究采用去卵巢配合电刺激的方法复制大鼠围绝经期失眠模型，并采用目前临床常用的神门、四神聪配穴进行治疗，观察该方法对大鼠睡眠时相的影响，并通过其对脑脊液(Cerebrospinal Fluid，CSF)中前列腺素D2(PGD2)系统及下丘脑腹外侧视前核(VLPO)中γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)的影响，来探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康Wistar大鼠30只，雌性，5～7月龄，体质量(250 g±20)g，清洁级，购自长沙天勤生物技术有限公司，实验动物许可证号：SCXK(湘)2014-0011。

1.1.2 试剂与仪器 “华佗牌”针灸针(0.35 mm×25 mm,苏州医疗用品有限公司)；大鼠失眠刺激器(哈尔滨电工仪表研究所)；G6805型电针治疗仪(上海医用电子仪器厂)；多道生理记录仪(美国Biopac公司)；大鼠脑立体定位仪(美国Stoelting公司)；大鼠Elisa试剂盒(L-PGDS、PGD2、PGE2，R&D Systems，Inc)，YN-05MY型全自动免疫组化染色系统(深圳市永年科技有限公司)，HBS-1096A全自动酶标仪(北京华泰和合有限公司)。

1.2 分组

30只实验大鼠适应性喂养1周后，40 mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，固定于脑立体定位仪上，剪开头部毛皮层，钝性剥离筋膜，暴露头骨，脱脂棉擦拭，保持头骨暴露部位表面干燥，用脑立体定位仪分别在(坐标：AP-2,R2；AP+2,R2)用牙科电钻钻孔，并植入金属探针，使之与硬脑膜接触，但不穿透硬脑膜为宜[4-5]。将肌电电极植入颈部(近颅骨处)肌肉，用牙科水泥固定微型插座，缝合毛皮层，腹腔注射青霉素4万U/d，连续5 d，恢复21 d后，按照体质量区组化随机分为3组：假手术组、模型组与电针组，每组10只。

1.3 模型复制

模型组和电针组大鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后，仰位固定，剪开腹部毛皮层，钝性剥离肌肉层，结扎双层输卵管后，切除双侧卵巢，逐层缝合肌肉层及毛皮层[6]，腹腔注射青霉素4万U/d，连续5 d后，恢复21 d(手术恢复5 d后，逐只检查雌性大鼠阴道涂片，连续5 d，以不出现角化细胞为卵巢摘除成功的标志)。假手术组大鼠按照上述手术操作，不结扎，亦不切除卵巢。将3组大鼠置于电刺激器中，8 h连续电刺激足底(电流：0.5 mA，波宽：15 ms，频率：1 Hz，每隔30 min刺激30 s)后，采用多道生理记录仪监测大鼠12 h肌电图和脑电图(8:00—20:00)。

1.4 电针方法

电针组大鼠在模型复制的同时(卵巢摘除手术后第6天)开始针刺治疗，每日1次，连续治疗21 d，电针神门、四神聪穴位，平刺4～5 mm后连接电针治疗仪，频率：50次/s，调整刺激强度使大鼠针刺局部肌肉轻微抽搐，并保持大鼠相对安静为度，每次15 min。假手术组和模型组大鼠每日同时进行抓放操作，但不进行电针刺激。

1.5 生化检测

1.5.1 酶联免疫法测定CSF中L-PGDS、PGD2、PGE2水平 各组大鼠肌电图和脑电图监测后，将大鼠用戊巴比妥钠麻醉后，用脑立体定位仪固定，采用微量注射器于枕骨大孔处倾斜45°进针0.3～0.4 cm，抽取大鼠脑脊液100 μL，采用Elisa方法测定脑脊液中前列腺素D2(Prostaglandin D2，PGD2)、L型前列腺素D合成酶(L-PGD synthetase，L-PGDS)、前列腺素E2(Prostaglandin E2，PGE2)的浓度。

1.5.2 免疫组化法检测VLPO部位GABA的表达 脑脊液采样后，将实验大鼠断头取脑，在冰浴上分离大鼠下丘脑VLPO部位。将VLPO组织包埋后，进行冠状连续冰冻切片，切片厚度40 μm，用ABC法进行免疫组化染色，加入兔抗鼠c-fos(1∶1 000)抗体，在37℃条件下孵育2 h，采用生物素标记羊抗兔IgG，在37℃条件下温育1.5 h，复合物同样在37℃温育1 h后，DAB显色。

1.6 统计学方法

2 实验结果

2.1 电针神门、四神聪对失眠大鼠各睡眠时相持续时间的影响

与假手术组比较，模型组大鼠LS、SWS、REMS和TS均明显缩短(P<0.05)；与模型组相比，电针组大鼠SWS和REMS显著延长(P<0.05)，LS、TS虽有增加的趋势，但差异无统计学意义(P>0.05) 。见表1。

表1 电针神门、四神聪对失眠大鼠各睡眠时相持续时间的影响

2.2 电针神门、四神聪对失眠大鼠各睡眠时相所占比例的影响

与假手术组比较，模型组大鼠REMS所占睡眠总时间的比例显著降低(P<0.05)，LS和SWS所占比例变化差异无统计学意义(P>0.05)；与模型组相比，电针组大鼠REMS所占睡眠总时间的比例明显升高(P<0.05)，LS和SWS所占比例变化差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 电针神门、四神聪对失眠大鼠各睡眠时相所占比例的影响

2.3 电针神门、四神聪对失眠大鼠脑脊液中L-PGDS、PGD2、PGE2水平的影响

与假手术组相比，模型组大鼠CSF中L-PGDS、PGD2水平明显降低，PGE2显著升高(P<0.05)。与模型组相比，电针组大鼠CSF中L-PGDS、PGD2水平显著升高(P<0.05)，PGE2水平虽有降低的趋势，但无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 电针神门、四神聪对失眠大鼠CSF中L-PGDS、PGD2、PGE2水平的影响

2.4 电针神门、四神聪对失眠大鼠下丘脑VLPO部位GABA表达的影响

与假手术组比较，模型组大鼠VLPO部位GABA神经递质水平显著下降(P<0.05)。与模型组相比，电针组大鼠VLPO部位GABA神经递质水平显著升高(P<0.05)。见图1、表4。

表4 电针神门、四神聪对失眠大鼠脑VLPO部位GABA表达的影响

3 讨论

女性绝经后，体内雌激素水平的断崖式下跌是围绝经期综合征的主要病因[7]。睡眠障碍是围绝经期的常见症状，中医学认为睡眠障碍属于不寐范畴，《难经·四十六难》中阐明了睡眠障碍的病机，“血气衰，肌肉不滑，荣卫之道涩，故昼日不能精，夜不得寐也”，因此治疗当以顺气机、滋心阴、安神定志为主[8]。针灸对于情志因素导致的失眠，疗效独特。神门穴属手少阴心经，位于尺侧腕屈肌与指浅屈肌之间，汇集前臂内侧皮神经和尺侧神经，中医认为，神门是心经之原穴，为心气出入之门户，针刺神门可养心安神，为治疗失眠的主要穴位，临床常用于治疗惊悸、怔仲、失眠、健忘等神志病证；四神聪属经外奇穴，位于百会四周各1寸，共有四穴，汇集枕大神经、耳颞神经及眶上神经的分支，中医认为，四神聪位于督脉，循行线上督脉入络于脑，具有调神醒脑开窍之功，可通过调节大脑功能失衡状态，以改善睡眠，临床常用于治疗失眠、健忘、眩晕、头痛等[9-10]。电针神门、四神聪、具有协同入眠、调节自律神经、补益心气、安定心神的作用。

摘除大鼠双侧卵巢是经典的复制围绝经期大鼠模型的方法[11]，广泛用于动物实验中。睡眠障碍不仅包括入睡困难，还包括嗜睡、睡眠质量差、多梦、易醒、醒后疲劳等。睡眠时相是常用的分析实验动物睡眠结构的方法，其中SWS期睡眠主要缓解躯体疲劳，REMS期睡眠对大脑疲劳的恢复有着十分重要的意义，LS属于浅睡眠是由觉醒向深睡眠过渡的阶段，相对而言，对机体的作用不如SWS期睡眠和REMS期睡眠关键[12]。本研究中，电针组大鼠SWS和REMS显著延长，REMS所占TS的比例亦显著提高，结果表明，电针治疗不仅增加了去卵巢失眠大鼠缓解躯体、大脑疲劳睡眠的时间，同时还部分恢复了大鼠的生理性睡眠结构。

PGD2最早是在1973年被发现的PGs家族成员，是一种包含有20个碳的不饱和脂肪酸，近年研究表明，其与睡眠的关系十分密切[13]。经典的实验研究表明，将PGD2注射入猴第3脑室后，发现SWS期睡眠和REMS期睡眠时间明显延长[14]，这与本研究的结果相对应，由此可见脑内PGD2是内源性的促进睡眠物质。PGE2同样是体内主要的PGs之一，其为脂类炎性介质，具有较高的生物活性，体内合成底物是花生四烯酸，由PGE2合成酶和过氧化酶联合催化而成[15]，在体内属于内源性的促进觉醒物质[16]。脑内的PGD2和PGE2的动态平衡对维持生理性的睡眠-觉醒具有重要的意义[17]。PGDS是PGD2合成的关键酶，PGDS又可分为2种亚型:H-PGDS和L-PGDS。H-PGDS的主要作用是催化外周PGD2的合成，而在中枢PDG2主要由L-PGDS催化产生，因此脑内的L-PGDS是调节睡眠觉醒周期的关键物质。中枢的PGD2与受体结合后，通过调节基底前脑细胞外腺苷激活VLPO部位增加GABA的表达抑制中枢兴奋促进睡眠[18]。由此可知，GABA是一种中枢抑制性神经递质[19]，局部含量升高具有促进睡眠的作用。本研究中，电针组大鼠CSF中L-PGDS、PGD2水平显著升高，VLPO部位GABA的表达也显著增加，结果可见，电针治疗后大鼠CSF中促睡眠物质明显增加，且部分恢复了PGD2-PGE2的动态平衡，进而对大鼠生理性睡眠结构的改善发挥明显的促进作用。

综上，电针神门、四神聪可以显著改善去卵巢大鼠的睡眠质量，其作用机制与增加CSF中促睡眠物质、部分恢复PGD2-PGE2的动态平衡以及增加PGD2下游信号通路中VLPO部位抑制性神经递质的表达有关。