不同针刺干预膝骨关节炎模型大鼠对NF-κB信号通路的调控影响*

李惠娟,张 栋,张晓哲,阮安民,陈 谱,周 俊,樊小燕,刘思婷,田 宇,沈家豪,彭浩轩,杨统杰,王庆甫

(1.北京中医药大学,北京 100029; 2.北京中医药大学第三附属医院,北京 100029)

膝骨关节炎(Knee Osteoarthritis,KOA)是以膝关节软组织炎症为主的退行性骨关节常见病,其病因病机目前尚未清楚。针刀疗法作为一种新的中医微创技术,近几年在治疗KOA有了满意的临床疗效[1]。本实验以KOA大鼠为研究对象,分别对大鼠内、外膝眼穴进行于预,使用针刀与相同直径的圆利针,行相同的针刀手法,针刀具有刀锋,而圆利针不具有。并观察大鼠行为学、软骨组织学及膝关节滑膜组织NF-κBp65 mRNA和IKB-α mRNA表达的影响。利用此研究,相信更能确切比较出圆利针的“针”与针刀的“刀”的不同差别,并进一步揭示针刀治疗KOA的作用机理。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

健康清洁级,雄性8周龄Wistar大鼠体质量(0.17±0.01)kg。由北京市维通力华实验动物有限公司提供,许可证号: SCXK(京)2016-0006,在中日友好医院实验动物中心动物室喂养,许可证号:SYXK(京)2016-0043。实验动物适应3 d后,将40只大鼠随机分为正常组、造模组、针刀组和圆利针组,每组10只。在实验过程中,对动物的处置符合动物伦理学。

1.2 实验试剂与仪器

1.2.1 主要针具 一次性无菌针刀,规格:0.35 mm×25 mm(乐灸牌,马鞍山邦德医疗器械有限公司);一次性无菌圆利针,规格:0.35 mm×25 mm(乐灸牌,马鞍山邦德医疗器械有限公司)。

1.2.2 主要试剂 木瓜蛋白酶(RH31265);L-半胱氨酸(RH32452);苏木素染色液(Harris粤珠械备20170022);伊红染色液(水溶性粤珠械备20170022);TRIZOL(Invitrogen,10296028);无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司,10009218);异丙醇(国药,40064360);DEPC(MDL,MD911875);UltraPure Agarose(ABI-invitrogen,16500100);SuperScript III RT 逆转录kit(ABI-invitrogen,11752050);Sybr qpcr mix(ABI-invitrogen,4472920)。

1.2.3 主要仪器 石蜡切片机(莱卡,德国,RM2206);组织石蜡包埋机(莱卡,德国,EG1150);数字切片扫瞄系统(奥林巴斯,美国,BX61VS);台式高速冷冻离心机(THERMO,美国,LEGEND MICRO 21R);分光光度计(THERMO,Nanodrop lite);移液器(Eppendorf);荧光定量PCR仪(Applied biosystems,美国,StepOne Software);电泳仪(biorad,EPS 300);凝胶成像仪(biorad,2500)。

1.3 大鼠膝骨关节炎造模方法

参照兔膝关节腔注射不同浓度的木瓜蛋白酶和L-半胱氨酸混合液诱导KOA模型的方法[2]。

木瓜蛋白酶造模方案:造模开始的第1、4、7天,于模型组大鼠右后膝关节腔注射药物(4%木瓜蛋白酶与0.03 mol/L浓度的L-半胱氨酸以1∶1比例,混匀静置0.5 h),0.22 μm滤膜过滤,4℃备用。将大鼠右后膝周围绒毛剃除,湿纱布擦洗后用碘伏消毒。大鼠左后膝绒毛,也一并剃除,每周测量左右膝周径。在注射木瓜蛋白酶混合药物时,左手将大鼠右后膝轻微上屈,右手持1 mL的注射器从髌骨内侧刺入关节腔,每次注射量100 μL。注射7 d后,圈养大鼠4周,诱导大鼠KOA模型。

1.4 干预方法

1.4.1 正常组 正常饲养,不做任何干预。

1.4.2 造模组 造模后,不做任何干预治疗。

1.4.3 针刀组 造模成功后第3天,进行针刀干预,每周1次,共治4周。

1.4.4 圆利针组 于造模成功后第3天针刺,使用与针刀相同直径的圆利针,行与针刀组相同的手法,每周1次,共治4周。

圆利针组、针刀组均选取内、外膝眼穴。两穴均参考《实验针灸学》[3]中“常用实验动物针灸穴位”进行治疗。两穴位于髌韧带两侧凹陷处,直刺约3 mm;所有干预结束后1周取材。针刀组与圆利针组,具体操作与治疗步骤如下:造模成功后,将Wistar造模大鼠固定于治疗台上,在鼠膝关节选取内、外膝眼穴作为针刀进针点,以龙胆紫定位标记,常规性消毒,然后针刀刺入,刀口线与韧带方向平行,针体与皮肤垂直,刺入约3 mm,出针刀并用棉球按压3 min止血。每周干预1次，共4周。

1.5 行为学检测方法

干预前和干预后1周的两个时间点,应用改良Lequesne MG[4]的膝关节评估法对正常组、造模组、针刀组和圆利针组的鼠膝关节进行行为学评价,观察项目包括步态改变、疼痛刺激反应、关节肿胀和关节活动等4个部分。

1.6 取材及指标检测

治疗结束1周后,处死大鼠进行取材,在超净工作台上,快速取出右后膝关节滑膜组织,一部分置于冻存管内,液氮迅速冷冻保存,用于Real-time PCR检测。另一部分取软骨,10%中性多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片和HE染色，于光镜下观察组织,根据Mankin评价鼠膝KOA模型病理分期。

1.6.1 实时荧光定量PCR(Real-time PCR)法 PCR检测滑膜组织NF-κBp65和IKB-α基因表达水平,将滑膜组织从液氮中取出,在预冷的研钵中加入液氮快速研磨成粉末,将粉末放置于预冷的离心管中,具体步骤按照试剂盒要求进行。具体引物序列见表1。

表1 PCR引物序列

1.6.2 Mankin软骨组织学评分检测方法 Mankin软骨组织学[5]检测对正常组、造模组、针刀组和圆利针组鼠膝关节进行软骨组织学评价,观察项目包括蛋白多糖(HE染色法)、结构、细胞和潮线完整性。

1.7 统计学处理

采用SPSS22.0软件进行统计学分析,定量资料以均数±标准差表示。组间比较先行检验各组的数据是否符合正态分布，符合正态分布数据采用独立样本t检验分析(Independent sample t test)和单因素方差分析(One-way ANOVA)，若不符合正态分布,则应用非参数检验分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠行为学评价比较

干预前造模组、针刀组、圆利针组均显著高于正常组(P<0.01);干预后针刀组、圆利针组均显著低于造模组(P<0.01)。见表2。

表2 Lequesne MG动物行为学评分结果

2.2 各组大鼠右后膝关节软骨组织学观察

2.2.1 正常组 软骨区域的潮线清晰可见,同源细胞群清晰可见。软骨细胞大小均一。软骨表面光滑,无血管翳生成。见图1。

2.2.2 造模组 软骨细胞增生,软骨潮线消失。软骨基质增生,厚度增加。软骨表面细胞破坏严重,表层软骨细胞稀少。血管翳普遍存在,新生血管出现。见图1。

2.2.3 针刀组 软骨潮线清晰可见,软骨细胞排列正常,未见软骨细胞增生。软骨表面较光滑,偶见血管翳生成。见图1。

2.2.4 圆利针组 部分潮线模糊断裂,软骨细胞基本呈正常状态,表层软骨细胞较正常组减少。有少量血管翳形成。见图1。

2.3 各组大鼠膝关节Mankin软骨组织学评价比较

大鼠膝关节软骨切片HE染色后,以100倍和400倍光镜观察，见图1。可见关节软骨分为浅表层、中间层、深层和钙化层4个区域,其中深层和钙化层之间有一层清晰的边界称为潮线,并应用Mankin软骨组织学评价软骨破坏程度。

图1 各组大鼠右后膝关节软骨切片HE染色结果

各组组间评分比较针刀组与圆利针组差异无统计学意义(P>0.05),造模组、针刀组、圆利针组评分均显著高于正常组(P<0.01),针刀组、圆利针组评分均显著低于造模组(P<0.01)。见表3。

表3 各组大鼠Mankin软骨组织学评分

2.4 各组大鼠实时荧光定量比较

PCR检测滑膜NF-κBp65、IKB-α基因表达。NF-кB信号通路关键元件IKB-α mRNA和NF-κBp65 mRNA各组表达水平比较,NF-κBp65 mRNA表达在针刀组、圆利针组和造模组均显著高于正常组(P<0.01),IKB-α mRNA表达在针刀组、圆利针组均高于造模组(P<0.05),针刀组高于圆利针组和造模组(P<0.05)。见表4。

表4 各组大鼠滑膜组织NF-κBp65 mRNA和IKB-α mRNA水平比较

3 讨论

本实验应用改良的Lequesne MG评估法观察大鼠动物行为学,造模组与正常组的行为学评分呈正相关,表明木瓜蛋白酶成功的模拟KOA所致的膝关节功能受限的状态。干预后针刀组、圆利针组的Lequesne MG评分均与造模组呈负相关,表明针刀治疗和圆利针治疗均可以有效改善KOA模型动物的膝关节功能,而针刀组在缓解疼痛和改善膝关节功能方面的评分均优于圆利针组。

膝关节软组织的疼痛是KOA最主要的临床症状,疼痛包含了静息疼痛和牵涉疼痛等,而疼痛会进一步造成膝关节功能(如步态改变、关节活动受限)的下降,临床治疗的主要目的就是为了改善疼痛症状。在本实验中采用了圆利针干预组为阳性对照组,从改善膝关节功能和缓解疼痛等这几方面对比针刀干预的疗效,并深入探讨针刀治疗的作用机制。临床上,由于多种原因导致KOA的一些临床表现,包括膝周软组织发生黏连和挛缩、屈伸受限出现僵硬现象或伴随患侧的股四头肌痉挛萎缩、正常肌力下降等问题,严重影响了病患的日常生活[6]。

在Mankin软骨组织学评价方面，造模组评分与正常组呈明显正相关(P<0.01),说明木瓜蛋白酶很好的模拟了KOA的病理表现。针刀组、圆利针组评分均与造模组呈负相关(P<0.01),说明了两个治疗组与造模组相比较均有所改善,且其中针刀组改善程度显著高于圆利针组。从HE染色切片结果显示,针刀组治疗效果优于圆利针，这与覃蔚岚[7]、嵇波[8]等学者的研究结果一致，针刀疗法可降低KOA软骨退变,有助于形成软骨母细胞的趋势,并可促进软骨新生纤维和骨细胞的形成。

膝关节软骨附着在髌股和胫股关节的表面,发挥了减震和润滑的功能[9]。在KOA疾病的进程中,关节软骨一方面因为力学环境改变,使得运动轨迹发生异常;另一方面因膝周无菌性炎症扩展,导致关节液中的炎性因子含量升高,致使代谢发生异常进而加速了软骨的退变。本课题组前期实验研究[10-11]表明,软组织滑膜炎症是KOA的重要病理变化,与KOA的骨性结构破坏有密切相关。从本课题组前期临床研究[12]亦可发现,早期KOA以无菌性软组织炎症表现为主,针刀治疗可明显改善滑膜炎症增生,进而缓解KOA症状。在晚期,KOA软组织炎症逐渐减退,关节软骨的破坏成为主要病理表现。

前期研究发现,NF-κB信号通路在KOA滑膜炎症中,软骨破坏激活表达显著[13]。在不同阶段的KOA,软骨和滑膜组织也显著表达,并与KOA分期的软骨形态学改变有明显相关性[14]。NF-κB包括NF-κB家族及其抑制物IKB家族,调控着炎症基因和多种免疫的信号传导[15]。NF-κB在正常的生理机能中有重要作用，并参与了KOA多种病理性激活和软骨细胞前炎症因子表达[16-17]。NF-κB抑制因子IKB家族成员中,IKB-α是最早被克隆的分子,也是至为重要的。IKB泛素化后被蛋白水解酶降解,使转录因子NF-κB激活,启动前炎性因子特异性的基因转录和表达[18-19]。

在本实验中发现,与正常组相比较，造模组膝关节滑膜组织NF-κBp65 mRNA含量明显增高(P<0.01),IKB-α mRNA含量明显降低(P<0.05),说明在KOA的炎症反应过程中有NF-κB信号传导机制参与;与造模组相比较,针刀组膝关节滑膜软组织中NF-κBp65 mRNA含量明显降低(P<0.01),IKB-α mRNA含量值明显增高,表明针刀对KOA模型大鼠膝关节软组织中NF-κBp65 mRNA的表达有抑制作用，而IKB-α mRNA 表达有升高的作用,这说明了针刀干预可改善大鼠膝关节滑膜软组织中NF-κB的高调控状态，从而抑制滑膜炎性细胞因子和炎性介质的合成与分泌，这有可能是针刀实现其抗炎效应并治疗KOA的作用机理之一。

本实验初步探索了Wistar大鼠行为学、软骨组织学和滑膜组织基因在KOA模型中的变化情况,并采用了刺激强度和刺激量都比一般毫针作用大的针刀和圆利针进行治疗。从临床可知,针刀最主要切割的是肌筋膜,对软组织附着的肌筋膜进行切割,使肌肉软组织的内压减小,肌痉挛也随之解除[20]。王常海等[21]在研究报告中也明确指出,针刀医学对KOA的认识在于膝关节和其周围保持恒定的动态力学平衡。针刀具有“刀”以及“针”的双重作用,“刀”可对软组织进行松解,调节软组织的力学平衡,起到一定减压作用。而“针”能缓解局部疼痛,改善微循环,达到“通则不痛”的治疗目的。对照组采用圆利针疗法是因为圆利针的治疗思路和针刀相近,在中医理论的指导下,以现代运动医学和解剖学为原则,通过松解手法对粘连的软组织进行剥离,可对膝周的阳性反应点形成多个减压通道,能降低内部组织的压力,改善痉挛状态,促进膝关节的力学失调达到平衡[22]。

综上所述,KOA软组织痉挛处通过针刀进行剥离与切割,打破KOA发病机制的恶性循环,改善膝关节动态平衡,促进动物行为学评分,改善滑膜组织NF-кB信号通路的高调控状态，从而抑制滑膜炎性因子和介质的合成与分泌,这有可能是针刀实现其治疗KOA的作用机制之一。