蛴螬对兔光损伤视网膜变性Caspase-8、 Bax、Bid、Caspase-3 mRNA表达的影响

蒋鹏飞，彭俊，吴大力，彭清华,3*

(1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.中医药防治眼耳鼻咽喉疾病湖南省重点实验室，湖南 长沙 410208；3.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；4.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023)

随着激光在眼科检查及治疗的广泛应用，由激光所致的医源性视网膜光损伤也越来越多，长期光照的积累效应对视网膜有损伤作用，可诱导多种眼科疾病[1-2]，如老年性黄斑变性。早在《晋书》中就有蛴螬在眼科的应用记载，研究表明蛴螬对光损伤所致视网膜变性有治疗作用[3]。为明确其作用机制，本实验对视网膜光损伤后凋亡因子Caspase-8 mRNA、 Bax mRNA、Bid mRNA、Caspase-3 mRNA的表达进行了检测，探讨了不同剂量蛴螬提取物对视网膜光损伤兔模型的保护作用。

1 材料

1.1 实验动物

30只雄性健康实验性兔(湖南中医药大学动物实验室提供，合格证号：医动字第20-002号)。

1.2 实验仪器

台式冷冻离心机(湘仪，TGL-16)；普通冰箱(荣事达，BCD-245F)；精密pH计(雷磁，E-201-C)；电子天平(民桥，FA-N)；超净工作台(北京亚泰隆，YT-CJ-2NB)；直热式二氧化碳培养箱(上海三藤仪器，DH-160I)；倒置生物显微镜(北京中显恒业仪器，DSZ2000X)；荧光倒置显微镜(OLYMPUS，IX51)；-80 ℃冰箱(中科美菱，DW-HL388)；恒温水浴箱(J-MAX，HH-2)；摇床(其林贝尔，TS-92)；恒温箱(北京六一，DYY-6C)；微波炉(美的，MM721AAU-PW)；显微镜(奥林巴斯，CX41-72C02)；酶标仪(汇松，MB-530)；荧光定量RCP仪(Thermo，PIKOreal 96)；荧光PCR板(Thermo，SPL0960)。

1.3 主要实验药品和试剂

蛴螬提取物(参照谭涵宇等[3]所用制备方法制取)；琼脂糖(西班牙)；EDTA(Sigma)；Tris(Sigma)、Trizol(Invitrogen);Taq酶(Genstar)；DL2000 DNA Marker(Genstar)；dNTP(Genstar)；E.B.(Sigma)；SYBGREEN PCR Mix Mix(ABI)；DL2000 DNA Marker(Genstar)；dNTP(Genstar)；SYBGREEN PCR Mix Mix(ABI)。

2 实验方法

2.1 分组方法

采用随机数字表将30只兔随机平均分为空白组、模型组、蛴螬低剂量组、蛴螬中剂量组和蛴螬高剂量组。

2.2 造模方法

采用自制光化学损伤装置[3]对实验兔进行36 h的光照，光照后送回暗环境中饲养。空白组不施行光照试验。

2.3 给药方法

空白组和模型组以生理盐水5 mL/kg灌胃；蛴螬低剂量组按0.45 g/kg配成5 mL蛴螬提取物混悬液；蛴螬中剂量组按0.9 g/kg蛴螬提取物配成5 mL蛴螬提取物混悬液；蛴螬高剂量组按1.8 g/kg蛴螬提取物配成5 mL蛴螬提取物混悬液。每日灌胃1次，给药14 d后处死全部兔子后取材。

2.4 取材方法

动物耳缘静脉注射空气处死后，立即摘除眼球，在手术显微镜下仔细剥离激光斑部位视网膜，备行PCR检测Caspase-8 mRNA、 Bax mRNA、Bid mRNA、Caspase-3 mRNA的表达。

2.5 指标检测

2.5.1 HE染色观察标本视网膜细胞结构

经脱水、脱蜡、洗蜡、乙醇浸泡、水洗、染色、分色等步骤，在光学显微镜下观察并拍照。

2.5.2 RT-qPCR法检测视网膜Caspase-8 mRNA、 Bax mRNA、Bid mRNA、Caspase-3 mRNA的表达

参照Gene Bank数据库中各目的基因的序列下载基因序列，用 primer premier 6.0进行引物设计，设计的引物由武汉赛维尔生物科技有限公司合成，具体引物序列如表1所示。实验加入试剂见表2；加入冷却反应液中的试剂见表3。

表1 引物序列表

表2 加入试剂名称及量

表3 加入冷却反应液中的试剂及量

2.6 统计学处理

3 结果

3.1 各组实验性兔视网膜组织HE染色结果

空白组：实验性兔视网膜结构层次分明。模型组：视网膜层次结构模糊，分界不清，出现不规则淡染。蛴螬低剂量组：视网膜外核层胞核排列较疏松。蛴螬中剂量组：视网膜外核层胞核排列较整齐密集。蛴螬高剂量组：视网膜外核层胞核排列较整齐，厚度有增加。见图1。

注：A.空白组；B.模型组；C.蛴螬低剂量组；D.蛴螬中剂量组；E.蛴螬高剂量组。图1 各组实验性兔视网膜组织HE染色结果(×400)

3.2 各组视网膜Caspase-8 mRNA、 Bax mRNA、Bid mRNA、Caspase-3 mRNA表达情况

各组视网膜组织中检测指标Caspase-8 mRNA、Bid mRNA相对表达量空白组与模型组比较均有统计学意义(P<0.05)，空白组与蛴螬低、中、高剂量组相比，差异均有统计学意义(P<0.05)，模型组与蛴螬低、中、高剂量组相比，差异均有统计学意义(P<0.05)，蛴螬低、中、高剂量组两两比较，差异无统计学意义(P>0.05)；各组视网膜组织中检测指标Bax mRNA、Caspase-3 mRNA相对表达量空白组与模型组比较有统计学意义(P<0.05)，空白组与蛴螬低、中、高剂量组相比，差异均有统计学意义(P<0.05)，模型组与蛴螬低、中、高剂量组相比，差异均有统计学意义(P<0.05)，蛴螬中、高剂量组与蛴螬低剂量组相比，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 各组视网膜组织Caspase-8 mRNA、Bax mRNA、Bid mRNA、Caspase-3 mRNA相对表达量比较

4 讨论

眼底激光作为高能量的单色光，对视网膜的灼伤属于眼外伤范畴，多导致视衣气阴受损，气虚血瘀。目珠脉道幽深细微，经络分布周密，气血纵横贯目，若激光灼伤目珠，气阴受损，脉络瘀滞，使神光发越受阻，视功能减退。目得阴血而能视，气脱者目不明，神光赖其真气、真血、真精之滋养，方能明视万物。益气则神光有所滋养，同时，气旺以促血行；活血化瘀则目珠脉道通畅，气血可以纵横贯目，神光方能有所发越。故治疗常以益气活血化瘀为主，辅以养阴利水。

蛴螬有破血、行瘀、散结、通乳之功效，《神农本草经》中最早有记载：“主恶血血瘀痹气，破折血在胁下坚满痛，月闭，目中淫肤、青翳白膜。”前期研究发现蛴螬对血-视网膜屏障有保护作用[4]，有抑制视网膜新生血管的作用[5]，对视网膜静脉阻塞后视网膜感光细胞有保护作用[6-7]。当光照损伤了视网膜，视网膜感光细胞发生慢性氧化应激反应[8-9]，逐渐凋亡[10]。感光细胞的大量凋亡后，视力会急剧下降[11-12]。

Caspase-8是凋亡的起始因子，Caspase-8激活后视网膜感光细胞发生凋亡，Bax与Bid均是促凋亡蛋白，可将凋亡信号传导至线粒体[13-14]，同时Bid还可以促进Bax向线粒体膜的插入和多聚体的形成。Caspase-3是内质网凋亡途径的最终凋亡因子[15]，只有Caspase-3的表达增高，才能说明发生了内质网凋亡途径[16]。

本实验发现模型组Caspase-8、Bax、Bid、Caspase-3 mRNA表达增加，蛴螬低、中、高剂量组Caspase-8、Bax、Bid、Caspase-3 mRNA表达减少。提示视网膜光损伤可能通过激活细胞凋亡的死亡受体通路，引起光感受器细胞凋亡导致视网膜损伤；蛴螬可能通过抑制细胞凋亡的死亡受体通路活化，最终达到有效拮抗光损伤诱导的光感受器细胞的凋亡。

综上所述，蛴螬通过抑制了视网膜感光细胞凋亡因子Caspase-8、Bax、Bid、Caspase-3 mRNA的相对表达，从而抑制了视网膜感光细胞的凋亡，改善视网膜超微结构，改善了视功能。其疗效与剂量相关，中、高剂量疗效较好。