发光细菌在线监测水体污染研究进展

王 颖，廖訚彧，欧阳莎莉，彭泓波，黄周洲，陈 斌，廖倩文

(长沙市水质检测中心，湖南长沙 410000)

随着信息化水平的提高，在线仪器的技术发展，水质在线监测已经广泛应用于环保、水利、卫生、城市供排水等行业。水利部的大型饮用水源地基本都安装了水质在线监测仪，生态环境部的国家水质自动监测预警系统也已经建成，主要水系国家断面的数据可在中国环境监测网站国家地表水水质自动监测实时数据发布系统查看。随着河湖长制的推行，一些城市行政分界断面或重要河流支流断面的自动监测站也应运而生，譬如目前，长沙一江六河共建成水质自动监测站34个。2020年1月武汉暴发疫情后，雷神山火神山医院相继建成，其医疗废水排放实现了实时在线自动监测。国内外当前比较前沿的水质自动在线监测体系有3类仪表。第一类为常规多参数仪表：主要有pH、电导率、浊度、溶解氧、水温、叶绿素、悬浮物等在线监测仪；第二类为特征污染物仪表：主要有重金属、挥发性有机物(VOC)、氨氮、总氮、总磷、高锰酸盐指数、总有机碳、余氯等在线监测仪；第三类为在线生物毒性仪：主要有发光细菌类、鱼类、藻类、蚤类等在线监测仪。其中，常规多参数和特征污染物主要针对国家水质质量标准中的单个指标；而在线生物毒性是一个综合水质评价指标，发光细菌在线生物毒性监测是20世纪70年代后期发光细菌与现代光电子技术结合产生的一种新的监测技术[1]。国家环境监测“十二五规划”中提到“地表水试点监测,逐步在重要水体断面增加重金属和生物毒性、挥发性有机物等自动监测项目,满足重点领域、湖库水质预警监测要求”，这是首次国家层面的政策文件提及生物毒性在线监测。

作为一种新的水质监测技术，在线生物毒性监测技术展现了独有的优势，与以往在线监测方法完全不同，可以检测重金属、农药、生物毒物、其他有机和无机有毒物质，体现的是一种综合指标，能更好地预警水体中的有毒物质，更科学地避免重大突发性水污染事件风险。

关于在线生物毒性监测的研究进展，主要从各类生物传感器角度，水生动植物类(鱼类、蚤类、藻类)、微生物类(发光细菌、硝化细菌、氧化亚铁硫杆菌)[2-4]进行综合评述。发光细菌法是其中的一个主要方面，暂时还没有文章从发光细菌生物毒性的角度来细分领域研究进展，本文从原理、性能指标、标准、在线生物毒性监测技术(发光细菌法)在水质监测的应用、生物毒性在线监测仪研究状况进行阐述。

1 发光细菌监测水质生物毒性的原理和生物毒性结果的评价

1.1 基本原理

水样在一定的时间和条件下与发光细菌接触后，发光细菌的发光强度与水样中毒性组分总浓度呈负相关关系，通过生物发光光度计测定水样与发光细菌接触15 min后的发光抑制率来表征水样的急性毒性水平。发光细菌的生物发光反应是由于分子氧作用，细胞内荧光酶催化将还原态的黄素单核苷酸及长链脂肪醛氧化为黄素单核苷酸及长链脂肪酸，并释放出最大发光强度在490 nm处的蓝绿光。

生物毒性的表征指标为相对发光强度或抑光率，相对发光强度是测试样本发光值(样品管发光值)与控制样本发光值(对照管发光值)对比后所得，结果以百分比表示。抑光率一般为正值，有时候抑光率会呈现负值，此时说明水中存在使发光菌菌数增加的有机物，即可同化有机物(AOC)及可生物氧化有机物(BDOC)。

1.2 生物毒性结果的评价

国家海洋局《污水生物毒性监测技术规程 发光细菌急性毒性测试-费歇尔弧菌法》提到，样品毒性水平的表征方法采用检测结果中的15 min发光抑制率H进行评价。 根据H大小将毒性等级分为3级，相应等级分别为低度毒性风险、中度毒性风险、高度毒性风险，分级方法如表1所示。中科院土壤研究所制订的水质毒性分级标准中[5]，根据相对发光率的大小将毒性等级分为低毒、中毒、重毒、高毒、剧毒5个等级，如表2所示。

表1 污水样品毒性风险等级评价方法Tab.1 Evaluation Method for Toxicity Risk Grade of Sewage Samples

表2 水质急性毒性分级标准Tab.2 Classification Criterion of Acute Toxicity of Water Quality

2 发光细菌监测水质生物毒性的标准

图1 3种发光细菌类型Fig.1 Three Types of Luminescent Bacteria

表3列出了明亮发光杆菌(P.phosphore-um)[12-14]以及费氏弧菌(Vibriofischeri)[15]等所涉的国内外标准。ISO 11348的3个标准，主要区别在于费氏弧菌的状态不同：第1标准采用的是新鲜制备的费氏弧菌；第2标准采用的是液体干细菌；第3标准采用是冻干粉细菌。其中，ISO 11348-3-2017是应用最广泛的国际标准。涉及青海弧菌的暂时没有标准，仅在《水和废水监测分析方法》第四版书籍中提到。

ISO 11348-3-2017与GB 15441—1995相比，主要有以下两点区别。(1)利用的发光菌不同，且保存菌种的温度不同，前者用的是费氏弧菌，保存温度为-20 ℃；后者为明亮发光细菌，保存温度为2～5 ℃；因此，对于需要长期保存的冻干粉而言，冷冻温度越低越好。(2)前者要求测定加入水样前发光细菌的原始荧光强度，并根据对照试样做出校正，避免了细菌样品不均匀带来的误差影响。

表3 发光细菌监测水质生物毒性的标准Tab.3 Standard for Monitoring Water Biotoxicity with Luminescent Bacteria

3 在线生物毒性监测技术(发光细菌法)在水质监测中应用

3.1 在线生物毒性监测技术在地表水监测中的应用

常州市某水源地和武进水质自动站安装了荷兰Toxcontrol在线生物毒性监测仪，吴礼裕等[16]利用该仪器自2008年12月得到的25万个数值进行综合统计分析，给地表水和饮用水制定了预警限值。其中，武进水质自动站下限报警值为-5%，上限报警值为20%；某饮用水源地水质自动站下限报警值为-5%，上限值为15%。顾俊强等[17]采用明亮发光杆菌生物传感器，利用在线集成实现了连续自动监测，在毒物分析、性能测试、比对方法等方面进行了研究，应用连续3年的运行数据，确定了本地水样的静态及动态报警限。研究表明，生物毒性在线监测技术能很好地与传统的特定项目预警技术有机结合，可作为水质综合性评估的有效补充，满足饮用水源地水质在线预警需求。张迪生等[15]通过对汞、镉等重金属的生物毒性剂量效应进行分析，准确评估了生物毒性监测方法在饮用水源地水质监测中的预警意义，结果显示，5种元素的生物毒性: 汞>砷>铅>镉>铬，结合南京上坝饮用水源地的生物毒性数据，建立了用于评价水质安全的动态报警限。

3.2 在线生物毒性监测技术在排水监测中的应用

薛银刚等[18]尝试运用Toxcontrol 在线生物毒性监测仪连续自动监测某污水厂初沉池、二沉池、排水口的排水毒性，并把化学需氧量、氨氮和总磷3种排水常规理化指标作为参考，统一进行研究。研究表明，该污水厂排水口常规理化指标均达标，但连续监测和瞬时样品的平均排水毒性为高毒，平均毒性：排水口>初沉池>二沉池。即使在理化指标达标的情况下，该排水仍具有很强的毒性；Toxcontrol 系统在用于废水生物毒性的在线监测和评价时有较好的潜力。Kim等[19]利用Lee等[20]发明的一种多通道在线生物毒性监测仪，用于韩国2座电厂(1座核电厂、1座热电厂)排出冷却水的毒性监测。该仪器包含DPD2540、DPD2794、TV1061、GC2这4个通道，每个通道采用的重组发光菌株不同，对毒性的响应也不同，分别针对破坏膜、DNA、蛋白质和细胞的有毒物质的响应。利用DPD2540对核电站冷却水样进行测试，发现该水样呈现剧毒状态；当水样按体积比1∶2和1∶1稀释时，相对发光强度分别为1.9%和1.5%，证明稀释水样降低了原来水样的毒性。

3.3 在线生物毒性监测技术在饮用水监测中的应用

周方洁等[21]分别采用WQMS2000-TOX水质生物毒性检测仪的在线检测方法和传统的离线水质生物毒性检测方法对无锡市南泉原水厂自来水进行测试。结果表明：在线监测方法的抑制率为2.12%，精密度为0.74%；离线监测方法的抑制率为2.46%，精密度为1.39%。由此可知，在线监测方法抑制率和离线监测方法相似，但精密度更高。

2015年5月1日—10月31日在米兰举行的世界博览会期间，为了保证饮用水的安全，米兰负责向世博会供水的环境机构采用了一种新型的在线生物毒性监测仪[22]分析监测供水毒性。意大利饮用水标准，水厂制备的水的余氯为0～0.2 mg/L。该在线生物毒性监测仪，采用的菌种为中国科学院南京土壤研究所的明亮发光杆菌，当余氯在0～0.2 mg/L时，此细菌的活性并不受余氯的影响。为期6个月持续毒性监测测试水样2 435次(每90 min测试1次)、参比样品184次(每天测试1次)，对测试结果进行统计评价，得出水样平均抑制率为-5.5%±6.2%，空白相对标准偏差为2.0%±1.6%，样品相对标准偏差为1.4%±1.2%，空白和样品相对标准偏差低于欧洲标准(DIN EN ISO 11348-3-2009)[23]建议的3.0%的偏差。

3.4 应急监测

魏峰等[24]利用ToxSniffer 综合毒性仪在丰水期对湖州区域进行水质生物毒性监测，8月和9月各发现1次其水质生物毒性超过了该区域的生物毒性上限(4.7%)。经调查发现，期间当地连降暴雨, 水源周围地表的污染物冲刷到水库中。据美国环保局的一项研究报告，雨水径流存在一定的毒性。因此，采用ToxSniffer 综合毒性仪对水源地进行生物毒性监测，15 min即可得到结果，迅速且准确，监测谱足够宽, 能够监测500 种以上的有毒物质, 满足一级应急快速监测的需求。

4 发光细菌在线生物毒性监测仪研究现状

4.1 性能指标

国内第一个生物毒性水质自动在线监测仪的标准《生物毒性水质自动在线监测仪技术要求 发光细菌法》(DB 44/T 1946—2016)[25]中提到，该仪器的基本性能指标有精密度、灵敏度、贮存温度控制误差、测量温度控制误差、最小维护周期、检测周期、实际水样比对试验7项性能指标。精密度是指纯水、1 mg/L硫酸锌标准溶液、水样各测试7次后的相对标准偏差，此标准的性能指标和范围如表4所示，为通用的性能指标。国内外的厂家根据自身仪器的特点形成的性能指标如表5所示。

表4 地方标准性能指标及范围Tab.4 Performance Index and Range of Local Standards

4.2 仪器组成单元

发光细菌生物毒性监测仪一般由进样单元、菌种储存单元、检测单元、控制单元4部分组成，如图2所示。

表5 国内外在线生物毒性仪典型代表测试性能指标Tab.5 Test Performance Indexes of On-Line Biological Toxicity Instrument at Home and Abroad

图2 仪器的基本组成Fig.2 Basic Composition of Instrument

4.3 国内外主要仪器品牌型号

国外在线生物毒性监测仪的型号主要有荷兰的Toxcontrol、德国拉尔的Toxalarm、英国的Microtox CTM、比利时的Vibriotox等。2010年，第一台国产在线生物毒性监测仪聚光科技的Tox-2000诞生，其设计基于发光细菌法，之后在线生物毒性监测仪才逐渐发展起来。国内在线生物毒性监测仪基于原理可以分为两类：第一类为发光细菌法，典型代表有聚光科技公司(Tox-3000)、力合科技(湖南)股份有限公司(LFTOX-2010)、北京京象环境科技有限公司(WTF5200)、深圳市朗石科学仪器有限公司(LumiFox 8000)等，基于发光细菌法(明亮杆菌和费氏弧菌)原理商品化的在线生物毒性仪占据了市场的绝大部分；第二类为斑马鱼法，典型代表有深圳市水务集团开天源(RTB 2000)，以斑马鱼为生物传感器的商品化在线仪器只占市场的一小部分。斑马鱼卵法和发光细菌法最大的不同在于受试生物不一样。2019年，国家发布了标准《水质 急性毒性的测试 斑马鱼卵法》(HJ 1069—2019)[26]，也预示未来此类仪器将会得到快速发展。除此之外，国内这些公司均为科研型公司，很多都多次承担国家重点科技项目，有些更是国家工程中心和省级工程中心，具有强大的研发能力。在国家大力支持科研的形势下，国内在线监测生物毒性仪的研发、生产呈现良好的趋势。

4.4 发光细菌在线生物毒性监测仪的研究现状

4.4.1 菌种制备技术发展

菌种技术的发展重点在于发光细菌冻干制剂制备技术[27]。菌种的冻干制品直接由冰晶升华制成，具有多孔结构，既能使细菌保持原有活性，又不会破环细胞的形态以及特性。冷冻干燥是将细菌悬浮液冷冻到冰点以下，从而转变为固体结晶态，然后在低温低压(真空)下使固体升华而脱水的干燥方法。与新鲜菌液相比，菌种制成冻干制品后可以长期保存，简化了发光细菌法的前期工作。杨毅红等[28]发明了一种海洋发光细菌冻干制剂(明亮杆菌)及其制备方法，属于微生物冻干制剂范畴。该冻干制剂包含菌泥和冻干保护剂，且经菌液制备、菌泥制备、混合、预冻和冻干等步骤制备而成。该保护剂制得的海洋发光细菌冻干粉于2～8 ℃下保存18个月后，菌种恢复发光率及菌种发光性能均维持稳定，能极大地提高海洋发光细菌菌种的保存效果和质量，便于环境毒性检测中对菌种的使用。

4.4.2 菌种在线活化技术运用

商品化的生物在线监测仪一般维护周期为2周。发光细菌冻干粉复苏后的有效期一般不超过10 d，聚光科技和希思迪联合开发的T3000运用了仪器菌种自动保存和在线活化技术，将维护周期延长到28 d。赵东红[29]发明了一种水质生物毒性在线检测的装置，包括制样单元(水样预处理单元)、机械手单元、取样检测单元及驱动分析单元，且制样单元和取样检测单元均采用平行双通道的技术方案，可实现参比水样和待测水样的同时测定，消除了系统误差和测量偏差，设计了菌液储存池和菌液复苏池，通过在线活化技术实现维护周期的延长。Bodini等[22]研究了一种新型的细菌管理装置，其由1个开瓶器和1个装有冻干细菌的3个小瓶的冷藏室组成。整个过程编程自动运行，包括打开小瓶、添加22 mL的缓冲液复苏细菌、丢弃耗尽的细菌等操作。

4.4.3 平行双通道技术的应用

2010年，聚光科技TX2000采用的是单通道技术[30]，蠕动泵将空白对照液和待测样品按顺序泵入流路，同时，蠕动泵也将缓冲液和菌液泵入流路，三者混合在混合环，混匀反应一定时间后到达光电检测装置。此时，软件控制光电检测装置获取有用的光信号，分别得到参比光度值和样品的光度值。为了保证系统误差和测量误差的消除，运用平行双通道可以实现参比水样和待测样品的同时测定[31]。平行双通道技术的运用也增加了仪器成本，主要是参比反应池和样品反应池独立分开、测试管路两路、光电检测器的增加等。

4.4.4 信息化技术

传统的在线监测仪器，其基础的信息处理技术为设备驱动、实时监控、数据管理、远程预警，但这已经不能满足水质管理的要求，因此，通过信息化技术实现数据更高层次的利用是未来发展的方向。黄静[32]发明了一种在线生物毒性监测仪，对待测试水样进行测试，得到水样的水样测试反应过程曲线以及抑制率。利用毒性物质毒性分级清单确定抑制率对应的毒性等级，利用曲线相似性算法对水样测试反应过程曲线进行曲线形状相似性识别，依据抑制率从标准毒性物质的反应过程测试曲线数据库中识别相似度最高的反应过程测试曲线，并将其对应的毒性物质信息作为待测试水样的毒性物质信息。该方法实现了对水质毒性信息的分级分类，解决了现有技术中无法对水质中毒性物质量化的问题，且通过曲线形状相似性识别提高了分级分类的准确性。

4.4.5 移动式监测技术应用

现有的在线生物毒性监测仪基本都是安装在固定的自动监测站点来实现各类水质的在线监测，仪器体积大，不适合野外自动运行。汤冬云等[33]发明了一种水质综合生物毒性在线监测自动分析仪器，设置有独特的光电检测单元，集成度高、结构小巧、便于移动，适用于野外测试，同时自动化程度高，能够在线实时监测，无需人工值守，且检测灵敏度高、准确度好。

4.4.6 联合技术应用

现有的技术中，进行生物毒性监测时，通常只使用单一生物传感器，但不同的生物传感器对不同污染物的反应是不同的。例如，发光菌对金属比较敏感，而对有机物不太敏感，鱼类则相反，利用单一生物的反应来判断水体污染的情况，无法做到全面了解水污染的状况。因此，桂子荣等[34]设计了一种基于鱼类和发光菌的在线生物毒性监测仪，利用双光路监测模块同时监测水样池和参比池的微生物荧光信号，并将荧光信号转换成电信号传递至控制单元分析；利用行为监测器对试验鱼类的行为进行跟踪拍摄，根据鱼类群体活跃程度、鱼群离散程度等群体参数变化对水体污染情况进行监测。

5 展望

国家对水环境质量监测越来越重视，基于发光细菌法的在线生物毒性监测方法从“十二五规划”开始到“十三五”也取得了很好的进展。随着生活水平的提高，现代社会对饮用水的水质要求也越来越高(从“合格水”转变为“优质水”)。

(1)发光细菌毒性生物监测方法在水环境中有广泛的应用，发光细菌菌种技术未来发展的方向：更稳定、更高灵敏度发光菌种的研究；菌种的冻干制备技术的进一步发展。

(2)发光细菌在线生物毒性监测仪的发展方向：针对饮用水低毒的特点，发光细菌在线生物毒性监测仪应向更低检出限发展；针对废水水体的复杂性，在线生物毒性监测仪水样分析预处理技术是研究的主要方向；多物种同时监测可以更好地提升数据的可信度和精密度，将发光细菌生物监测仪作为基础，与其他物种监测仪共同开发联合技术将是发展的一个方向。随着其他生物传感器(斑马鱼)等标准的实行，未来在线生物毒性监测仪的种类将更加丰富，监测方式也将更加立体。