结核菌素试验在四川省布拖县HIV感染/AIDS患者中筛查结核感染的价值

李婷 何金戈 苏茜 李京 李运葵 高文凤 高媛 杨文

结核病是HIV感染与AIDS患者最常见的机会性感染和最主要的死亡原因之一[1]，2018年全球有86.2万例新发结核病患者并发HIV感染，25.1万例结核病死亡患者为HIV感染者[2]，且有30%～60%的HIV感染/AIDS死亡者可能生前未进行过结核病诊断[3]。因此，HIV感染/AIDS患者并发结核感染已成为全球及我国重要的公共卫生问题，如何切实有效地发现HIV感染/AIDS患者并发结核感染，降低该人群病死率，已成为一项亟需探讨的重要课题。结核菌素纯蛋白衍生物(purification protein of tuberculosis，PPD)试验是一种辅助诊断结核病的常用和传统方法，也是检测潜伏性结核感染(latent tuberculosis infection, LTBI)的经典方法[4-5]，但其检测HIV感染/AIDS患者中结核感染的敏感度与特异度还有待进一步评价，尤其缺乏大样本的研究结果支撑。为进一步了解PPD试验在该人群中的筛查价值，以及与该人群并发活动性肺结核的关系，本研究在‘十三五’国家科技重大专项研究的基础上，首次在凉山彝族自治州(简称“凉山州”)HIV感染/AIDS患者中开展结核病筛查的大规模横断面调查研究，旨在为HIV感染/AIDS患者并发结核感染的进一步研究提供科学依据。

资料和方法

一、研究对象

2016年以来，“‘十三五’国家科技重大专项——凉山州布拖县艾滋病综合防治示范区规模化现场队列研究”已准确掌握布拖县九都乡、木尔乡、特木里镇(简称“两乡一镇”)约3万名人口的健康体检档案信息及HIV感染状况，发现并管理2159例HIV感染/AIDS患者。本研究于2018年12月至2019年8月，从上述管理患者中纳入可随访且已接受免疫抑制剂治疗>1个月的688例患者开展结核病现场筛查和全血CD4+T淋巴细胞计数检测，对符合条件者进行MTB病原学检测。

排除175例未进行PPD试验结果核验、40例未行胸片检查且无结核病病原学诊断依据和7例非结核分枝杆菌感染的患者后，最终纳入466例患者；其中男237例，女229例；年龄2～70岁，中位年龄为37岁；463例(99.36%)患者为彝族。统计PPD试验结果及专家组根据PPD实验结果及其他临床资料判定的活动性肺结核或LTBI情况，继而分析PPD试验对活动性肺结核的检测效能及其阳性率与不同CD4+T淋巴细胞计数患者间的关系。所有患者在现场筛查和资料采集前均签署知情同意书。

二、研究方法

1.结核病现场筛查程序：本研究在布拖县人民医院开展集中现场筛查。包括对全部调查对象进行问卷调查[包括患者基本信息(性别、年龄、职业、婚姻状况)、结核病可疑症状(包括咳嗽、咳痰持续2周以上，反复咳出带血的痰，反复发热持续2周以上，夜间经常出汗，无法解释的体质量明显下降，经常容易疲劳或呼吸短促，淋巴结肿大)、既往史、结核病病史、HIV感染途径等]、PPD试验、胸部X线摄影(简称“胸片”)检查及血CD4+T淋巴细胞计数检测。对符合下列条件的被调查者可在现场留取即时痰，在72 h查验PPD试验结果时回收晨痰和夜痰进行MTB病原学检测：(1)具有任意一项肺结核可疑症状者。(2)胸片显示肺结核病变或疑似结核病变者。(3)已知活动性肺结核患者但胸片未见异常者。(4)确实不能参加胸片检查的调查对象(行动不便者、孕妇等)。以上调查和检查结果均填写在体检表中。

2.结核病分类及诊断：(1)根据《WS 196—2017结核病分类》[6]将结核病分为LTBI、活动性结核病、非活动性结核病。(2)病原学阳性为痰涂片萋-尼(Z-N)染色镜检、分枝杆菌固体培养或环介导等温扩增法分子生物学快速检测任一阳性。(3)按照《WS 288—2017 肺结核诊断》[7]标准，本研究由临床诊断专家组经集体讨论确定活动性肺结核和LTBI。

3.问卷调查：由经过培训的可使用彝汉双语的布拖县医院和“两乡一镇”的乡镇卫生院医务人员作为调查员开展一对一询问式问卷调查。结核病可疑症状问卷内容与《结核杆菌/艾滋病病毒双重感染防治工作技术指导手册》[8]一致。共计发出问卷688份，收回有效问卷688份，有效率为100.0%。

4.PPD试验方法及结果判定：在调查对象左前臂掌侧前1/3中央皮内注射0.1 ml(5 IU)TB-PPD试剂(北京祥瑞生物制品有限公司生产)，72 h后查验皮肤试验反应，测量注射部位硬结平均直径[(横径+纵径)/2]大小及观察注射部位有无双圈、水疱、坏死及淋巴管炎等强阳性反应。PPD试验结果分为阴性(硬结平均直径<5 mm或无反应者)、一般阳性(硬结平均直径<10 mm但≥5 mm)、中度阳性(硬结平均直径<15 mm但≥10 mm)和强阳性(硬结平均直径≥15 mm或局部出现双圈、水疱、坏死及淋巴管炎者)。由于调查对象均为HIV感染/AIDS且接受免疫抑制剂治疗>1个月的患者，本研究将一般阳性及以上视为PPD试验阳性及结核感染[7]；将仅PPD试验阳性但缺乏病原学和活动性肺结核影像学证据者视为LTBI；将PPD试验阳性且符合活动性肺结核影像学改变者视为活动性肺结核。

5.CD4+T淋巴细胞计数和分级：采集患者抗凝全血，24 h内使用美国BD公司FACSCalibur流式细胞仪检测CD4+T淋巴细胞计数。根据《WS 293—2019艾滋病和艾滋病病毒感染诊断》[9]中CD4+T淋巴细胞计数的分级情况，将CD4+T淋巴细胞计数分为4个层次，分别为≥500个/μl(提示无免疫缺陷)、350～499个/μl(提示轻度免疫缺陷)、200～349个/μl(提示中度免疫缺陷)、<200个/μl(提示重度免疫缺陷)。

6.质量控制：制定实施细则；由国家级和省级专家对参加现场筛查的工作人员进行统一培训，严格按照操作规范进行；问卷调查采用一对一的面对面询问方式，筛查项目由调查员引领调查对象进行检查，核实问卷及体检表后回收并发放交通补助；省级工作人员作为质控人员全程参与并立即核查每天收回后的问卷及体检表有无逻辑错误和(或)漏项，核实无误后及时录入并妥善保存体检表；筛查发现的所有疑似结核病患者，报国家级、省级专家组确认；前期通过预调查10例符合条件患者来修订调查程序。

三、统计学处理

采用 Excel 2010和SPSS 21.0软件进行数据的录入和统计学分析。以专家组确诊的活动性肺结核为参考标准，评价PPD试验对活动性肺结核的检测效能(包括敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和一致率指标)。计数资料采用χ2检验或连续校正χ2检验(理论频数<5且≥1时)，以P<0.05 为差异有统计学意义。

结 果

一、PPD试验检测结果

466例患者中，PPD试验阴性者377例(80.90%)、一般阳性者14例(3.00%)、中度阳性者29例(6.23%)、强阳性者46例(9.87%)，阳性率为19.10%(89/466)，89例阳性者(一般阳性及以上)均符合结核感染的诊断。

二、PPD试验对活动性肺结核的检测效能

466例患者经结核病筛查程序和专家定诊，确定89例为并发活动性肺结核，377例为未并发患者，并发率为19.10%；确定LTBI患者57例，检出率为12.23%(57/466)。以专家组确诊的活动性肺结核作为参考标准，PPD试验检测活动性肺结核的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和一致率见表1。

表1 以专家组确诊的活动性肺结核为参考标准评估PPD试验对活动性肺结核的检测效能

三、PPD试验结果与是否并发活动性肺结核及CD4+T淋巴细胞计数水平的关系

PPD试验阳性率在并发与未并发活动性肺结核患者中的差异有统计学意义(P=0.000)，见表2。对本研究有CD4+T淋巴细胞计数检测结果的409例患者进行分析，显示并发活动性肺结核患者的PPD阳性率均高于未并发者，但仅在CD4+T淋巴细胞计数≥500个/μl时差异有统计学意义(表3)。同时发现未并发活动性肺结核患者的PPD阳性率在不同CD4+T淋巴细胞计数下的差异无统计学意义(χ2=4.291，P=0.232)；而并发活动性肺结核患者上述指标的差异有统计学意义(χ2=5.024，P=0.025)且呈递增趋势，见表3。

表2 并发和未并发活动性肺结核患者的PPD试验结果及阳性率的比较

表3 不同CD4+ T淋巴细胞计数在并发与未并发活动性肺结核患者PPD 试验结果中的分布

讨 论

四川省凉山州是我国最大的彝族聚居区，位于四川省和云南省交界处，由于社会经济文化落后、特有的民风民俗致传染病多发，是结核病、AIDS高负担地区[10]。布拖县位于凉山州东南部，彝族人口占95%，长期处于AIDS高流行状态，“两乡一镇”的HIV感染率在全县较高，MTB/HIV双重感染一直是当地公共卫生防控难点。

既往研究发现，四川省肺结核患者中的HIV感染阳性检出率高于北京、广东、河南、河北等地的研究结果，且彝族患者的检出率明显高于汉族[11]。本研究结果显示，HIV感染/AIDS患者中活动性肺结核的检出率为19.10%，远高于2006—2007年河南、四川、云南和广西四省(自治区)中6个艾滋病高疫情县的检出率(6.4%)[12]和2012 年重庆市的检出率(1.09%)[13]，考虑可能与本次调查是对管理的HIV感染/AIDS患者的集中筛查，且筛查程序较为完善，并由专家组综合临床诊断路径和实验室方法进行诊断有关，也可能说明布拖县MTB/HIV双重感染疫情较其他地区严重。

HIV感染/AIDS患者免疫功能缺陷，其并发LTBI是开展预防性抗结核治疗的必要前提，准确掌握该人群的结核感染现状及其流行病学特征，及时诊断结核病是降低该人群并发结核病的有效手段，对临床诊治和降低病死率有着重要意义，是实现WHO “终止结核病策略”目标的重要突破口[14]，但如何确认该人群结核感染是目前最大的难题[12]。本次调查LTBI的检出率为12.23%，低于代佳伟等[15]对云南省传染病专科医院121例HIV感染/AIDS患者(排除活动性肺结核后)进行PPD试验检测的LTBI检出率(14.9%)，结合该研究PPD试验阳性判定标准(硬结平均直径≥10 mm)高于本研究标准的情况，考虑与云南省结核感染现状较本研究更严重或是样本量差异较大有关。由于在HIV感染者中，LTBI每年进展为活动性结核病的风险为7%～10%，明显高于HIV阴性者[16]；加之Diel等[17]的研究也表明，PPD试验阳性预示着未来有2.3%的概率会发展成为活动性结核病，故笔者建议应高度重视HIV感染/AIDS患者中的LTBI者，建议对其开展预防性干预，降低其发展为活动性肺结核的风险。近年来，γ干扰素释放试验(如T-SPOT.TB)被许多国家用于辅助诊断结核病及判断LTBI，但WHO[18]认为，γ干扰素释放试验在敏感度和特异度方面较PPD试验并未显示出更明显的优势，建议结核病高负担地区可以仅采用PPD试验筛查HIV感染人群中的LTBI者。

本研究以专家组确诊的活动性肺结核为参考标准，发现PPD试验的敏感度(35.96%)仅略高于钱小军等[19]对45例MTB/HIV双重感染者进行PPD试验检测的结果(31.58%)。而且，2013年Gao等[20]在我国选择了4个不同结核病疫情地区的农村全人口(5周岁以上)，开展了目前全球最大规模的结核感染的流行病学调查和队列研究项目，共计筛查约22 000人，PPD试验硬结平均直径≥5、10、15 mm的人口比例分别为40%、28%和19%，明显高于本研究PPD试验3个阳性等级反应的比例(分别为19.10%、16.09%和9.87%)，进一步证实了在免疫力低下、应用免疫抑制剂、营养不良等患者中，PPD试验的敏感度不高，存在假阴性反应较多的情况[21]；但本研究另一方面显示，PPD试验的检测特异度较高(84.88%)，可认为将PPD试验阴性者判断为非结核感染具有较高的真实性。另外，研究还显示，HIV感染/AIDS并发活动性肺结核患者的PPD试验中度及以上阳性的构成比是未并发患者的两倍以上，提示PPD试验反应强度越大，越有可能并发活动性肺结核。

比较不同CD4+T淋巴细胞水平的HIV感染/AIDS患者并发和未并发活动性肺结核的PPD试验结果，发现并发患者在CD4+≥500个/μl时的PPD阳性率(52.00%)明显高于未并发患者(16.67%)，差异有统计学意义，与伊朗的一项研究结果相似[22](即CD4+≥500个/μl的MTB/HIV患者的PPD试验阳性率高于<500个/μl者)；也与国内的多项研究结果一致，如黄劲华和李凡[23]、谢志满等[24]的研究发现，随着患者CD4+T淋巴细胞计数的增多，PPD阳性率也逐渐增高，且前者的研究显示，当CD4+<200个/μl时，HIV阳性患者的PPD试验结果均为阴性。说明HIV感染/AIDS并发活动性肺结核患者的免疫系统受损越严重，越不易对结核菌素发生免疫反应；而当免疫功能正常时，机体更易对PPD产生反应，致PPD试验阳性率较高，且随着CD4+T淋巴细胞计数的增多而增高。提示在实际工作中，当对HIV感染/AIDS患者进行PPD试验时，应考虑到免疫力低下对PPD试验阳性反应的影响。

综上所述，PPD试验检测布拖县HIV感染/AIDS患者是否并发活动性肺结核的敏感度不高，需与其他检查方法联合使用；但PPD试验阳性率随患者CD4+T淋巴细胞计数的增多而增高，加之特异度较高，阴性结果可提示非结核感染，仍可作为HIV感染高流行和卫生资源有限地区的有效筛查方法。此外，本研究未查验卡痕，无法排除卡介苗接种对PPD试验结果的影响，希望在今后的研究中予以考虑。