荧光PCR探针熔解曲线法检测结核分枝杆菌耐药性的价值

李爱芳 崔晓利 康磊 雷静 党丽云 杨翰

结核病是严重危害人类健康的全球十大致死原因之一，尤其是耐药结核病的出现使结核病治疗困难重重，结核病防治任重道远[1]。因此，高效精准的药物敏感性试验(简称“药敏试验”)和耐药监测对结核病的控制至关重要。BACTEC MGIT 960液体药敏试验(简称“MGIT 960药敏试验”)是目前检测结核分枝杆菌对一线抗结核药品耐药性的常用方法之一。但由于MTB生长缓慢，此方法耗时较长，约需14 d才能报告结果，以致患者延误诊断与治疗而错过最佳时机。

近年来，随着检测技术的不断进步，各种各样的分子诊断技术运用于结核病的诊断和耐药性检测中，为患者提供更加快速、准确的诊断和治疗建议。荧光PCR探针熔解曲线法(简称“熔解曲线法”)是目前临床应用较为广泛的一种分子检测技术，其通过监测特定耐药基因在熔解分析中的熔点变化来判定相应基因是否发生突变。已有文献研究了该方法检测结核分枝杆菌耐药性的价值，结果表明熔解曲线法对利福平和异烟肼的耐药突变检测具有较高的敏感度和特异度[2-4]。但仍然有10%左右的不一致结果会干扰临床医生对耐药性的判断，影响患者的治疗方案选择[3]。因此，本研究以MGIT 960药敏试验为参考标准，评价熔解曲线法对结核分枝杆菌临床分离株耐药性的检测效能，对MGIT 960 药敏试验和熔解曲线法检测利福平、异烟肼耐药性结果不一致对象采用基因芯片法耐药基因检测对熔解曲线法结果进行验证,进一步探讨分子和表型耐药检测结果不一致现象的可能原因和处理方式。

材料和方法

一、标本来源

收集全部2017年9月至2019年8月西安市胸科医院确诊的546例结核病住院患者作为研究对象，获得培养阳性菌株546株；经MPB64快速抗原检测初筛，531株为结核分枝杆菌，15株为非结核分枝杆菌，最终纳入531例(株)为本研究对象。收集患者痰标本，每份标本量均不少于2 ml。每例患者采用同一标本进行MGIT 960药敏试验和熔解曲线法耐药基因检测，对MGIT 960 药敏试验和熔解曲线法检测利福平、异烟肼耐药性结果不一致对象采用基因芯片法耐药基因检测对熔解曲线法进行验证。

二、研究方法

1.主要仪器与试剂：BACTEC MGIT 960全自动分枝杆菌培养及药敏检测系统(购自美国BD公司)，PCR扩增仪(购自美国BioRad公司), Lad-Aid 824s 核酸提取仪(购自厦门致善生物科技有限公司)，SLAN系列实时荧光定量PCR检测系统(购自厦门致善生物科技有限公司)，芯片杂交仪和微阵列芯片扫描仪(购自北京博奥生物科技有限公司), MGIT 960 液体药敏试剂盒(购自美国BD公司)，分枝杆菌核酸检测试剂盒(购自北京博奥生物科技有限公司)，Lad-Aid 824结核分枝杆菌核酸提取Maxi试剂(购自厦门致善生物科技有限公司)，结核分枝杆菌耐药基因突变检测试剂盒(链霉素、异烟肼、利福平、乙胺丁醇，购自厦门致善生物科技有限公司)，晶芯®结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒(DNA微阵列芯片法，购自北京博奥生物科技有限公司)。

2.标本前处理：痰标本用N-乙酰-L-半胱氨酸(NALC)-NaOH消化液处理15 min，加入磷酸盐缓冲液(PBS)至40 ml，4 ℃ 3000×g离心20 min，弃上清液，沉淀加入1.5 ml PBS振荡重悬。

3.BACTEC MGIT 960液体培养：参照《结核病诊断实验室检验规程》[5]取患者0.5 ml上述重悬液加入含分枝杆菌培养添加剂的液体培养管中，混匀后放入BACTEC MGIT 960液体培养系统，仪器报阳后取培养后菌液经萋-尼抗酸染色确认是否为抗酸杆菌，MTB64快速抗原检测阳性确认为初筛结核分枝杆菌。

4.MGIT 960 药敏试验：根据《结核病诊断实验室检验规程》[5]对培养阳性菌液采用MGIT 960药敏试验对链霉素、异烟肼、利福平、乙胺丁醇进行耐药性检测，各类药品浓度分别为 1.0 μg/ml、0.1 μg/ml、1.0 μg/ml、5.0 μg/ml。

5.熔解曲线法耐药基因检测[3]：按结核分枝杆菌耐药基因突变检测试剂盒说明书进行试剂配制，取5 μl待检核酸加入反应体系，瞬时离心，弹去气泡后上机检测。按照Lad-Aid 824结核分枝杆菌核酸提取试剂盒说明书进行核酸提取。

质量控制：使用0.5麦氏单位H37Rv菌悬液按照Lad-Aid 824结核分枝杆菌核酸提取试剂盒说明书提取核酸，与试剂盒自带阳性对照、阴性对照一起与样品同时进行检测。菌液熔解曲线与阳性对照结果均敏感为质控合格，阴性对照用于检测环境及操作过程中的污染。

6.结核分枝杆菌耐药基因检测(DNA微阵列芯片法)：对MGIT 960 药敏试验和熔解曲线法检测利福平、异烟肼耐药性结果不一致者采用基因芯片法耐药基因检测对熔解曲线法进行验证。按照博奥核酸提取试剂盒说明书要求进行标本前处理，提取痰标本中的DNA，按照晶芯®结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒(DNA微阵列芯片法)的说明书进行PCR扩增和芯片杂交，检测利福平的rpoB和INH的katG及inhA基因启动子的耐药基因突变碱基位点。

三、统计学处理

应用SPSS 19.0软件进行统计学分析，以MGIT 960药敏试验为参考标准，计算熔解曲线法检测结核分枝杆菌耐药性的敏感度、特异度和符合率，并进行一致性分析(Kappa检验)，Kappa值在0.41～0.60为中等一致，0.61～0.80为基本一致，0.81～1.00为几乎完全一致。

结 果

一、熔解曲线法的检测效能

以MGIT 960药敏试验检测结果为参考标准，熔解曲线法检测链霉素耐药性的敏感度、特异度和符合率分别为86.67%、99.38%和98.31%，一致性分析几乎完全一致(Kappa=0.887)；检测异烟肼耐药性的敏感度、特异度和符合率分别为69.23%、98.68%和94.35%，一致性分析基本一致(Kappa=0.751)；检测利福平耐药性的敏感度、特异度和符合率分别为87.50%、96.89%和96.05%，一致性分析基本一致(Kappa=0.778)；检测乙胺丁醇耐药性的敏感度、特异度和符合率分别为50.00%、98.83%和97.18%，一致性中等(Kappa=0.531)，见表1。

表1 以MGIT 960药敏试验为参考标准评价熔解曲线法检测MTB对链霉素、异烟肼、利福平、乙胺丁醇耐药性的效能

二、两种方法检测耐药性不一致的结果分析

在531例肺结核患者痰标本中，30例MGIT 960药敏试验与熔解曲线法检测MTB对异烟肼的耐药性结果不一致。其中6例为MGIT 960药敏试验检测结果为敏感而熔解曲线法检测到突变，具体位点均为katG315位密码子；有24例为MGIT 960药敏试验检测结果为耐药而熔解曲线法检测结果为敏感。基因芯片法耐药基因检测6例突变样本结果为katG315(AGC→ACC)突变和katG315(AGC→AAC)突变。

在531例肺结核患者痰标本中，21例MGIT 960药敏试验与熔解曲线法检测MTB对利福平的耐药性结果不一致。其中15例MGIT 960药敏试验检测结果为敏感而熔解曲线法检测到突变，具体为ropB507-512位密码子突变3例、ropB521-528位密码子突变3例、ropB529-533位密码子突变9例；6例分离株MGIT 960药敏试验检测结果为耐药而熔解曲线法检测结果为敏感。基因芯片法耐药基因检测15例突变样本结果为ropB基因511位CTG→CCG突变、526位CAC→TAC突变和531位TCG→TGG突变。

在531例肺结核患者痰标本中，9例MGIT 960药敏试验与熔解曲线法检测MTB对链霉素的耐药性检测结果不一致。其中3例为MGIT 960药敏试验检测结果为敏感而熔解曲线法检测到突变，具体突变位点均为rrs513-517位点；6例MGIT 960药敏试验检测结果为耐药而熔解曲线法检测结果为敏感。

在531例肺结核患者痰标本中，15例MGIT 960药敏试验与熔解曲线法检测MTB对乙胺丁醇的耐药性结果不一致。其中6例为MGIT 960药敏试验检测结果为敏感而熔解曲线法检测到突变，具体突变位点均为embB306位密码子；9例MGIT 960药敏试验检测结果为耐药而熔解曲线法检测结果为敏感。

讨 论

随着检测技术的不断进步和对MTB耐药机制的深入了解，耐药结核病的检测方法越来越多地应用于临床，且大大提高了耐药结核病的检出率。目前，分子药敏试验主要有基因芯片法、线性探针法和荧光PCR熔解曲线法等用于结核分枝杆菌耐药基因检测，对耐药性的辅助诊断具有快速、精准的意义[2-4,6-8]。

荧光PCR熔解曲线法结合了聚合酶链反应和荧光探针熔解曲线分析的优点，通过对目的基因进行扩增，观察其熔解温度与对照的差值(ΔTm)，从而判断是否有耐药基因突变。该方法简便、快速、高效，可以准确检出耐药基因的具体突变位点，适用于专科医院进行大批量样本检测。

本研究显示，与MGIT 960药敏试验相比，熔解曲线法检测结核分枝杆菌对4种一线抗结核药品耐药性的敏感度和特异度较高，均在95%以上。敏感度低于特异度的原因可能为试剂盒并不能覆盖所有耐药突变位点，以及存在低水平异质性耐药[9-10]。现有研究熔解曲线法在对利福平和异烟肼两种常用抗结核药品的耐药基因突变检测较多，而对链霉素、乙胺丁醇的检测较少。本研究在对链霉素的耐药基因突变结果显示，熔解曲线法与MGIT 960药敏试验相比，具有极好的一致性，其符合率达到98.31%。这与曹志华等[11]的研究结果一致。吴慧娜等[3]对异烟肼耐药基因突变的检测结果显示，以MGIT 960药敏试验为参考标准，熔解曲线法检测的敏感度和特异度分别为85.4%和96.4%。刘艳等[2]对利福平耐药基因突变的检测结果显示，以MGIT 960药敏试验为参考标准，熔解曲线法检测的敏感度和特异度分别为95.83%和95.50%；其敏感度高于本研究，特异度与本研究结果相近。本研究纳入531例患者痰标本进行耐药性分析，而刘艳等[2]只有135例标本纳入耐药性检测；敏感度方面的差异可能与样本量及检测水平等因素有关。对乙胺丁醇耐药基因突变的检测结果显示，以MGIT 960药敏试验为参考标准，熔解曲线法检测结果与MGIT 960药敏试验相比，其符合率高(97.18%)、特异度高(98.83%)；但敏感度只有50.00%，可能原因为试剂盒检测未能覆盖所有耐药突变位点。徐玉辉和张宗德[12]的研究发现，虽然embB306位点突变在对乙胺丁醇耐药的菌株中占有很大比例，但是对乙胺丁醇耐药可能存在如embA、embC和embR等其他基因的突变；而本研究试剂盒只能检测embB基因的306、378、406、497位点是否突变。

中国湖南[13]及美国加利利福尼亚[14]多地都检测到MTB对利福平耐药的ropB突变而表型药敏试验检测结果为敏感的现象，这些突变主要是有争议的511Pro、516Tyr、526Asn、526Leu、533Pro等突变位点，虽然这种不一致率不高，但对医生用药和治疗效果有较大影响。这两项研究均发现，在耐药基因ropB突变而表型药敏试验检测敏感的菌株(患者)大多对异烟肼也存在耐药现象，且一线抗结核药品治疗效果不好。这种表型药敏试验敏感而熔解曲线法检测到耐药基因突变位点的现象可能与低度耐药相关。因此，MGIT 960药敏试验虽然是耐药性检测的参考标准，但仍然存在一定的假阴性率，选择敏感度高的分子药敏试验检测方法可以提高耐药菌株的检出率。对于表型DST(MGIT 960药敏试验)与分子DST(熔解曲线法)结果不一致的患者，临床医师应引起重视。参考《结核分枝杆菌耐药性检测专家共识》[15]的建议，当分子药敏试验和表型药敏试验结果不一致时,需参考对不同抗结核药品分子药敏试验检测的敏感度和特异度;若是对利福平、异烟肼和氟喹诺酮类药品的检测结果,只要其中1种方法检测结果显示耐药,首先考虑可能是耐药或异质性耐药;若是其他抗结核药品则还需结合临床进行综合判断。

综上所述，熔解曲线法能够用于结核分枝杆菌耐药基因突变的快速检测，对结核病及耐药结核病的诊断治疗具有重要的参考意义。对于MGIT 960药敏试验与熔解曲线法检测结果不一致的患者，任一方法提示对异烟肼和利福平耐药，均要给予足够重视，必要时应该及时调整用药方案。