新疆肥胖人群尿液代谢轮廓分析

阿丽叶古丽·艾皮热，克力木·阿不都热依木，凯赛尔·艾则孜，李赞林2,，艾克拜尔·艾力2,

(1.新疆维吾尔自治区人民医院临床医学研究中心，新疆 乌鲁木齐，830001；2.新疆维吾尔自治区人民医院普外微创研究所;3.新疆维吾尔自治区人民医院微创、疝和腹壁外科)

肥胖症是体内热量摄入长期超过消耗量导致体内脂肪堆积过多或/和分布异常的复杂慢性代谢性疾病，与环境(包括社会与文化)、遗传、生理、代谢、饮食、行为及心理等多种因素有关，可引发糖尿病、高脂血症、冠心病、高血压、脂肪肝、睡眠呼吸暂停低通气综合征、慢性肾功损害、内分泌功能紊乱等多种严重代谢障碍性并发症与疾病，从而严重威胁患者身心健康，甚至影响寿命。超重及肥胖者随着BMI的增加，肥胖相关并发症发生风险增加，而且死亡率随体重增加呈几何级数升高。随着社会经济的发展及生活水平的提高，不论发达国家抑或发展中国家，肥胖症发病率正在逐年上升，已成为全球蔓延速度最快、最严重的公共卫生问题之一[1]。在美国，约1/3人口为超重，1/3人口为肥胖，肥胖仅次于过度吸烟排在可预防致死因素的第二位，每年直接或间接花在肥胖治疗上的费用超过1千亿美元[2]。肥胖症已被世界卫生组织认定为影响人类健康的五大危险因素之一。在国内情况同样不容乐观，中国疾病预防控制中心进行的中国慢性病调查显示，2007年与2010年中国成年人(18～64岁)超重的患病率分别为26.6%与30.6%，肥胖的患病率分别为7.7%与12.1%[3]。因此，如何有效控制体重，控制与减少肥胖及肥胖并发症的发生，已成为倍受关注的话题。开展与肥胖相关的课题研究也成为了新世纪的迫切任务。新疆是维吾尔族、汉族等多民族聚居地，地理环境与自然生态条件特殊，民族生活风俗习惯与饮食文化独特，动物高热量、高脂肪、高蛋白饮食相当普遍，因此在新疆地区肥胖更为高发。Song等的流行病学调查显示，在新疆维吾尔族人群总肥胖率高达23.57%，男、女性分别为18.12%与29.03%，明显高于全国平均水平[4]。目前针对新疆地区少数民族肥胖症的发病机理、生物相关标志物、早期预警系统建立等方面的研究较少。采用疾病代谢组学、蛋白质组学、基因组学等现代科技手段深入研究新疆少数民族肥胖症高发原因，具有重要的科学意义与实际应用价值。

代谢组学是系统生物学的重要组成部分，能对生物流体中的代谢产物与代谢中间物进行定性定量分析，发现由疾病过程引起的代谢异常，帮助人们更好地理解病变过程及机体内物质的代谢途径，还有助于疾病生物标志物的发现及辅助临床诊断的目的[5-6]。使用代谢组学技术研究肥胖的发生发展更具备宏观性、动态性与准确性。从而了解到肥胖及其相关疾病发生、发展过程中代谢物质与特征性蛋白表达的变化规律及其相关性，发现与疾病相关的异常代谢路径，并阐明与疾病相关的分子机制。但性别、年龄、饮食、生活方式及地域多样性等生理与环境因素严重影响代谢组学结果的可靠性与准确性[7-9]。然而新疆作为多民族地区，民族传统与饮食文化多种多样，在进行疾病代谢组学的研究过程中，如不考虑族别因素，会在代谢组学研究结果中引入大量假阳性的结果，严重干扰相关研究结果的可靠性。基于以上原因，本研究采用气相色谱-质谱联用仪(gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS)分析技术，系统研究新疆主要世居民族之一——维吾尔族健康正常体重、超重与肥胖人群尿液代谢轮廓，观察新疆维吾尔族正常、超重与肥胖人群尿液样本中代谢物，并发现与鉴定差异代谢物；进而发现肥胖与正常体重人群相比发生的根本的代谢改变。由于肥胖导致的机体代谢改变也可能是肥胖相关慢性代谢性疾病(代谢综合征、糖尿病等)形成与发展的原因，因此也可能找到肥胖相关慢性代谢疾病早期的生物标志物，为肥胖及其相关慢性疾病的早期发现与早期防治提供科学依据及新的思路。

1 材料与方法

1.1 标本收集与储存 研究对象均为2016年1月至2017年12月新疆维吾尔自治区人民医院体检中心健康体检与减重外科中心住院治疗的维吾尔族成人作为受试者，20～60岁。按照WHO肥胖分级标准将受试者分为三组，即正常体重组(18.5 kg/m2≤BMI<25 kg/m2)，超重组(25 kg/m2≤BMI<30 kg/m2)与肥胖组(BMI≥30 kg/m2)。为排除混杂因素，剔除恶性肿瘤、急性炎症、创伤、继发性肥胖、妊娠、严重心肺肝肾器质性疾病、精神病及有减肥手术史、服用对脂代谢有影响药物的患者。收集空腹晨尿30 mL，于-80℃保存。

1.2 实验材料 N，O-双(三甲基硅烷基)乙酰胺(98%)；三甲基氯硅烷、甲氧基胺盐酸盐(98%)；吡啶(分析纯)，十二酸(色谱纯)。

1.3 GC-MS分析样品前处理 根据文献报道[10]处理尿样，取200 μL尿样加20 μL尿素酶混悬液(相当于100 U尿素酶)，37℃培养箱内孵化1 h，降解尿液中的尿素。加1.7 mL甲醇，10 000 g离心10 min(4℃)。取1.5 mL上清液，用氮吹仪50℃下吹干溶剂。干燥后的样品中加入100 μL甲苯溶解混匀，再用氮吹仪50℃下吹干20 min干燥。干燥样品中加入50 μL甲氧胺60℃烤箱中反应2 h。加入7 μL (5 mg/mL)月桂酸对照溶液(内标物)。样品中快速加入100 μL MSTFA/TCMS (99:1)，60℃烤箱中反应1 h。样品降温至常温，移入GC瓶中待测。实验用样品取一定量漩涡混匀，再取混匀后的前处理样品200 μL，按样品的制备方法制备。每10个样品后放一个前处理样品检测。180个尿样需要18个前处理样品检测。

1.4 GC-MS分析条件 色谱条件[11]:Agilent HP-5MS(30 m×250 μm×0.25 μm)，载气：高纯氦气(纯度：99.999%)，柱流量1.0 mL/min。程序：升温条件初始柱温60℃，保留2 min，以10℃/min升温至280℃，维持10 min。进样口温度为280℃，接口温度280℃，进样量为 0.2 μL，分流模式：不分流。质谱条件：电离方式EI，碰撞能量为70 ev，离子源温度230℃，溶剂延迟时间为6.2 min，扫描方式：全扫描：40～600 m/z。

1.5 CG-MS 数据分析 通过安捷伦定性分析软件Masshunter的Find by Chromatogram Deconvolution功能查找未知化合物，归类，将原始数据的“.d”格式转换为“.cef”，对总离子流图进行特征离子提取，导入MPP软件(Agilent G3835AA MassHunter Mass Profiler Professional)进行数据预处理，得出的数据矩阵进行主成分分析(principal component analysis，PCA)，利用SIMCA-P 进行数据分型，利用NIST14质谱数据库进行比对，确定代谢标记物。

2 结 果

2.1 临床资料 肥胖组、超重组的BMI、腰围、舒张压高于正常组，差异有统计学意义(P<0.001)；肥胖组高密度脂蛋白低于超重组与正常组，差异有统计学意义(P<0.001)；3组患者性别、年龄、收缩压、血糖、低密度脂蛋白、游离脂肪酸水平差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 3组患者临床资料的比较

续表1

2.2 GC-MS结果

2.2.1 质量控制 选择内标物的特征离子峰进行分析，计算特征离子峰的保留时间偏移，峰面积偏差与离子精确质量数漂移。结果显示，特征峰保留时间偏移<0.1 min，峰面积的RSD<15%，精确质量数漂移值<7 ppm。由此可见，在代谢数据采集过程中，GC-MS系统稳定，所采集数据较为可靠。

2.2.2 PCA分析 从各组数据的PCA分析图可知，肥胖组、超重组、正常组的尿代谢物得到了较好的分离，且各组内聚合度较好。见图1、图2。

2.2.3 MPP分析差异代谢物 MPP软件分析肥胖组、超重组、正常组所有样品，共检测到3 995个化合物，进行组间出现概率>75%过滤筛选后得234个化合物；再进行组内出现概率100%筛选，得到54个化合物。One-Way ANOVA分析，组间进行多重比较，找到P<0.05的差异变量化合物16个。将化合物带回Masshunter 软件，筛选出峰形较好、差异显著的化合物，利用NIST14质谱数据库对可能的标记物进行鉴定，匹配度大于80%的鉴定结果较为可信。见表2。

表2 差异代谢物鉴别结果

3 讨 论

代谢组学从分子水平对代谢途径中的终端产物进行研究，在发现诊断疾病、评估疗效的新标志物及探究制定新的个体化治疗方案等方面均存在显著优势[12]，在疾病代谢组学研究中，众多内部与外部因素均影响生物样本中代谢物的组成与含量，导致代谢组学研究结果存在极大的可变性。饮食习惯、外界压力、身体健康状态、参加锻炼频率与强度等外部生理条件在动物实验中可通过严格控制，得到最大化的降低或消除这些因素的影响[13-14]，但针对人进行疾病组学研究，此法并不适用，导致相关代谢组学研究结果存在大量不可预测的变量。Lenz等[15]系统研究了英国与瑞典两个国家健康人群的尿液轮廓，发现由于两个国家间饮食倾向与文化的不同，人群尿液样本轮廓存在较大差异，如氧化三甲胺在瑞典健康人群尿液中含量中明显高于英国健康人群；Dumas等[16]系统考察了日本、芝加哥与中国的健康人群，证实了三个国家健康人群由于饮食、基因及肠道微生物等因素导致尿液轮廓出现差异。表明民族文化与传统的差异会导致不同族别人群尿液样本中代谢物的种类与含量存在差异，严重干扰相关疾病生物标志物的发现与鉴定。因此在对新疆地区高发病进行研究时，应充分考虑族别对疾病代谢组学研究产生的影响。

尿液中代谢物的波动不仅能反映机体整体代谢的特征，还可能是局部组织或器官功能异常的外在表现，因此，通过对尿液中存在的差异性代谢产物的检测可推测人体内的代谢过程。近年，对尿液代谢相关研究的报道较多，更有涉及肾细胞癌、前列腺癌、结肠癌、胰腺癌、胃癌等肥胖相关肿瘤性疾病，以及高血压、糖尿病、睡眠呼吸暂停症状等肥胖相关疾病[17-21]。而且GC-MS联用技术具备较为完善的质谱数据库，操作简便，具有较强的分离分析能力，已得到广泛应用[22-23]。Gompertz等应用气谱-质谱联用分析糖尿病患者尿液，结果发现a-羟基异戊酸、a-酮异戊酸、a-酮异己酸、a-酮b-甲基戊酸、b-羟基丁酸等升高显著，从而利用这5种有机酸联合进行糖尿病患者的初始筛查与诊断。Yuan等还分析了28例2型糖尿病青年男性患者的单纯性肥胖血液与尿液的代谢组学研究及26例健康人群尿中的有机酸谱，得到4种有机酸为2型糖尿病的标志物，也可对糖尿病患者进行明确诊断。那么使用代谢组学技术研究肥胖的发生发展就更具备宏观性、动态性与准确性。

本研究中我们通过GC-MS代谢组学技术检测肥胖、超重及健康对照组维吾尔族人群的尿液样本，共鉴定出葡萄糖、阿拉伯糖、L-苏糖酸、2-酮基-L-古龙酸、羟基丙酸、丙氨酸、甘油酸、柠苹酸、乳糖、尿酸、乙醇酸、赤藓糖醇、甘氨酸、棕榈酸单甘油酯、丁酸、纤维二糖等16种差异性代谢产物，其代谢途径主要涉及糖脂代谢、氨基酸代谢、能量代谢等。

3.1 糖脂代谢 本研究结果表明，在差异代谢物中葡萄糖依然是肥胖患者尿液中变化最为显著的代谢标志物，作为生物体内新陈代谢不可缺少的重要物质之一，它参与了众多代谢途径，包括脂代谢、能量代谢、氨基酸代谢等。肥胖患者体内由于存在胰岛素抵抗与分泌不足的情况，往往导致糖酵解减慢及血、尿中葡萄糖水平的升高。在与葡萄糖相关的代谢途径中，虽然糖酵解/糖异生途径最为重要，但作为重要的功能来源其参与了脂代谢、能量代谢等多种途径，因此综合分析才能得到更全面的信息。本研究发现，在超重及肥胖患者的尿液中均存在葡萄糖含量明显升高的特点，并伴随着能量代谢标志物及氨基酸代谢物的差异。

3.2 氨基酸代谢 本研究发现在超重及肥胖患者中，有甘氨酸、丙氨酸等氨基酸代谢物存在差异，表明肥胖患者体内发生氨基酸代谢的紊乱。氨基酸代谢差异可能与多种因素有关，如饮食习惯、生活环境等。其不仅是重要的营养物质，更参与了多种神经递质的功能，如甘氨酸、丙氨酸是抑制性神经递质，经谷氨酞胺转变后成为兴奋性神经递质。丙氨酸还是糖代谢与免疫系统的重要氨基酸。

3.3 能量代谢 本研究鉴定出与能量代谢有关的化合物主要有乳酸、丙氨酸。乳酸是糖酵解过程中由葡萄糖无氧降解而成。超重及肥胖患者尿液中的乳酸含量均高于于正常组，表明超重及肥胖患者存在有氧代谢障碍与无氧酵解失衡，出现了能量代谢的紊乱。此外，尿中氨基酸变化多系肝脏葡萄糖糖异生引起的，本研究发现，肥胖患者尿液中甘氨酸含量发生了变化，也可能由肝脏葡萄糖糖异生引起。丙氨酸参与了多种代谢途径，也是能量来源之一。尿液中丙氨酸含量增加，亦表明能量代谢水平发生了变化。由于影响代谢的因素很多，肝、肾、脑、肌肉、红细胞等组织器官均参与其中，代谢物的代谢途径多样，因此，从整体来看，肥胖症患者的能量代谢水平降低。在本研究中维吾尔族肥胖患者尿液中丙氨酸含量上升，表明葡萄糖的正常代谢被抑制。

丁酸是一种四碳短链天然脂肪酸，而短链脂肪酸既是体内重要的能量来源，由肠道微生物对食物中的碳水化合物发酵所产生的，而且它通过相应的受体调节基因表达，通过肠-脑轴调节能量平衡。本研究发现，肥胖患者尿液中丁酸含量发生了一定的下调。此结果与吴水芸[24]的报道结果一致。赤藓糖醇是一种糖醇，由酵母菌发酵而成，也存在于一些水果及发酵食品中，几乎不被人体肠道菌群的细菌消耗；因此过量的赤藓糖醇在尿液中未经修饰地排出[25]。本研究结果发现，超重及肥胖患者尿液中赤藓糖醇含量较正常体重组降低，表明超重及肥胖患可能菌群代谢发生了改变。

上述可见，肥胖症患者体内三大代谢均存在异常，某一代谢途径的改变引起关联途径的变化，从而形成恶性循环，最终造成累及全身的代谢紊乱综合征。在此后的研究中应重点揭露该代谢产物与肥胖并发症之间的确切关系，以便为治疗与预防肥胖症及其相关并发症提供理论依据。