罗丹明染料共振散射光谱法测定肝素钠注射液中肝素钠

赵文林，邹自力，宋佳宝，翟好英

(内江师范学院 化学化工学院，内江 641112)

肝素钠(Hep)是一种粘多糖类物质，是从猪、牛、羊的肠粘膜中提取的硫酸氨基葡萄糖的钠盐。其作为一种抗凝血药，具有防止血小板集聚和破坏、抑制纤维蛋白原转变成纤维蛋白单体、抑制凝血活素的形成、对抗已形成的凝血活素、阻止凝血酶原转变成凝血酶、对抗凝血酶等作用，可用于治疗急性血栓栓塞和弥散性血管内凝血等疾病[1]。因此，建立对实际样品中Hep含量测定的方法，对于人体健康具有重要的意义。目前，Hep的测定方法主要有共振散射法[1-3]、分光光度法[4-6]、荧光猝灭法[7]和伏安法[8-9]等。

罗丹明染料是一种碱性呫吨类染料，具有特殊的结构和荧光特性，可广泛应用于化学分析[10-11]和生物分析[12]领域。本工作研究发现，在酸性介质中，2种罗丹明染料[罗丹明6G(Rh6G)和丁基罗丹明B(b-RhB)]可通过静电引力作用分别与Hep形成离子缔合物，使2种体系的共振散射(RS)信号显著增强，且在一定范围内，2种体系的RS信号强度差(ΔIRS)与Hep 质量浓度之间均呈线性关系，但Hep-Rh6G 体系的线性范围更宽，检出限更低，据此，建立了一种Rh6G 共振散射光谱法测定Hep注射液中Hep含量的方法。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

F-4600型荧光分光光度计;p HS-3E型pH 计。

Hep标准溶液:称取0.025 0 g Hep，用水溶解，配制成100 mg·L－1肝素钠标准储备溶液，使用时，用水将此溶液稀释成10 mg·L－1标准溶液。

Rh6G 溶液:1.0×10－3mol·L－1。

b-Rh B溶液:1.0×10－3mol·L－1。

三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)-HCl缓冲溶液:用0.10 mol·L－1HCl溶液将0.10 mol·L－1Tris溶液的酸度调至pH 5.0。

Britton-Robinson (B-R) 缓冲溶液:将0.040 mol· L－1H3PO4溶液、H3BO3溶液、CH3COOH 溶液混合，用0.20 mol·L－1的Na OH溶液将其酸度调至pH 5.5。

Hep标准品为生化试剂，其他所用试剂均为分析纯;试验用水均为超纯水(电阻率约为18.25 MΩ·cm);肝素钠注射液(标示生物效价12 500 IU/2 mL)，批号分别为51161105 和171007。

1.2 试验方法

1.2.1 Hep-Rh6G 体系

取Hep注射液1.0 mL于100 mL容量瓶中，用水稀释至刻度。分取上述溶液1.0 mL 于100 mL容量瓶中，稀释至刻度。在10 mL比色管中依次加入Rh6G 溶液0.50 mL、样品溶液0.25 mL、Tris-HCl缓冲溶液0.50 mL，用水定容至5.0 mL，反应10 min。将反应后的溶液置于1.0 cm 石英比色皿中，在荧光分光光度计上同步扫描激发波长(波长范围为300～500 nm)和发射波长(波长范围为300～500 nm)，获得RS光谱。在377 nm 处分别测量样品溶液和试剂空白的RS信号强度，分别记为IRS和I0，计算两者的RS信号强度差ΔI(ΔI＝IRS－I0)来定量分析Hep。

1.2.2 Hep-b-RhB体 系

取Hep注射液1.0 mL于100 mL容量瓶中，用水稀释至刻度。分取1.0 mL 上述溶液于100 mL容量瓶中，稀释至刻度。在10 mL比色管中依次加入b-RhB溶液0.80 mL、样品溶液0.25 mL、B-R 缓冲溶液0.50 mL，定容至5.0 mL。将反应后的溶液置于1.0 cm 石英比色皿中，在荧光分光光度计上同步扫描激发波长(波长范围为300～500 nm)和发射波长(波长范围为300～500 nm)，获得RS 光谱。在380 nm 处分别测量样品溶液和试剂空白RS信号强度，分别记为IRS和I0，计算两者的RS信号强度差ΔI(ΔI＝IRS－I0)来定量分析Hep。

2 结果与讨论

2.1 分析波长的选择

试验考察了Hep标准溶液用量对Hep-Rh6G和Hep-b-RhB 体系RS 信号强度的影响，结果见图1。

由图1可知:当不添加Hep时，Rh6G 在320，377 nm 处有2 个较弱的RS 峰，b-RhB 在333，380 nm 处有2个较弱的散射峰。加入Hep后，2种体系的RS信号增强，且RS 信号均随体系中Hep标准溶液加入量的增大而增大，最大散射峰分别位于377，380 nm 处。因此，试验分别选择377，380 nm 作为这2种体系的分析波长。

图1 Hep标准溶液用量对Hep-Rh6G 和Hep-b-RhB体系RS光谱的影响Fig.1 Effect of amount of the Hep standard solution on RS intensity of Hep-Rh6G and Hep-b-RhB systems

2.2 缓冲溶液及其及酸度和用量的选择

试验考察了采用HCl 溶液、H2SO4溶液、H3PO4溶液、CH3COONa-CH3COOH 缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液(PBS)、Tris-HCl缓冲溶液和B-R缓冲溶液等7 种反应介质对Hep-Rh6G 体系和Hep-b-RhB体系的信号强度、灵敏度和线性关系的影响。结果表明:以Tris-HCl缓冲溶液为反应介质时，Hep-Rh6G 体系的灵敏度和线性关系均较好;以B-R 缓冲溶液为反应介质时，Hep-b-Rh B 体系的信号强度及线性关系均较好。因此，试验分别选用Tris-HCl缓冲溶液和B-R 缓冲溶液作为Hep-Rh6G 和Hep-b-Rh B体系的反应介质，并考察了这2种缓冲溶液的酸度和用量对Hep-Rh6G 体系和Hep-b-RhB体系RS强度的影响，结果见图2。

图2 缓冲溶液的酸度和用量对Hep-Rh6G 体系和Hep-b-RhB体系RS强度的影响Fig.2 Effect of acidity and amount of the buffer solution on RSintensity of Hep-Rh6G and Hep-b-RhB systems

由图2 可以看出:在Hep-Rh6G 体系中，pH 5.0时，ΔI最大;在Hep-b-RhB体系中，pH 5.5时，ΔI最大，故Hep-Rh6G 体系选取pH 5.0 Tris-HCl缓冲溶液，Hep-b-Rh B 体系选取pH 5.5 B-R 缓冲溶液。在Hep-Rh6G 体系中，当缓冲溶液用量为0.50 mL时，ΔI最大;在Hep-b-RhB 体系中，当缓冲溶液用量为0.10～0.50 mL时，ΔI较大且基本不变。综合考虑，试验选择这2种体系所用的缓冲溶液用量均为0.50 mL。

2.3 各试剂加入顺序的选择

试验考察了2 种罗丹明染料(Rh6G/b-RhB)、Hep和缓冲溶液等3种试剂的6种加入顺序对2种体系灵敏度和线性关系的影响。结果表明:当采用染料(Rh6G/b-RhB)、Hep、缓冲溶液的加入顺序时，2种体系均有较好的灵敏度和线性关系。

2.4 罗丹明染料用量的选择

试验考察了2 种罗丹明染料的用量对各体系RS信号强度的影响，结果见图3。

由图3 可以看出:在Hep-Rh6G 体系中，当Rh6G 溶液用量为0.50 mL 时，ΔI最大;在Hep-b-Rh B体系中，当b-RhB溶液用量为0.80 mL 时，ΔI最大。故试验选择2 种体系中Rh6G 和b-RhB 溶液的用量分别为0.50，0.80 mL。

图3 罗丹明染料的用量对RS信号强度的影响Fig.3 Effect of amount of the rhodamine dye on RS intensity

2.5 稳定性试验

按照试验方法进行稳定性测试，结果发现，2种体系的反应速率均较快，Hep-Rh6G 体系在10 min内反应完全，Hep-b-RhB体系在2 min内基本反应完全;且2种体系在1.0 h 内，RS 信号基本保持不变，说明这2种体系稳定性均较好。

2.6 标准曲线和检出限

按照试验方法分别对Hep-Rh6G 体系中的0.020，0.10，0.20，0.40，0.60，1.0，1.6，2.0 mg·L－1Hep标准溶液系列和Hep-b-Rh B 体系中的0.10，0.20，0.40，0.60，1.0，1.6 mg·L－1Hep标准溶液系列进行测定，以Hep的质量浓度为横坐标，其对应的ΔI为纵坐标绘制标准曲线。2种体系的线性参数见表1。

对试剂空白进行11次平行测定，计算其标准偏差s，根据3s和标准曲线的斜率(k)的比值计算检出限(3s/k)，结果见表1。

表1 线性参数和检出限Tab.1 Linearity parameters and detection limits

由表1可以看出:Hep-Rh6G 体系的线性范围更宽、线性关系更优、检出限更低。因此，试验选择Hep-Rh6G 体系对Hep注射液中的Hep含量进行测定。

2.7 共存物质的干扰

试验考察了30种可能共存的物质对采用Hep-Rh6G 体系测定1.0 mg·L－1Hep 标准溶液的影响。当相对误差小于±5%时，30种共存物质的允许倍数见表2，其中，“∗”用0.10 mol·L－1NaF溶液掩蔽。

表2 共存物质的影响Tab.2 The effect of coexisting substances

2.8 样品分析

按照Hep-Rh6G 体系的试验方法对2 个批次的Hep注射液样品进行测定，并以此为基质进行加标回收试验，每个样品平行测定5次，计算测定值的相对标准偏差(RSD)和回收率。样品分析结果见表3。

表3 样品分析结果(n＝5)Tab.3 Analytical results of the samples(n＝5)

由表3可知:2个批次的Hep注射液中Hep的回收率分别为96.0%，101%，测定值的RSD 分别为4.9%，3.9%。经换算，得51161105和171007两个批号样品的生物效价分别为13 165 IU/2 mL 和13 720 IU/2 mL，与标示生物效价的相对误差依次为5.32%，9.76%。

本工作发现，Hep可以增强Rh6G 和b-Rh B的RS信号强度，在优化的试验条件下，最终确定采用Hep-Rh6G 体系测定Hep注射液中Hep的含量，该方法精密度和准确度都较好，可作为荧光光谱探针测定实际样品中Hep含量。