云南萝芙木与催吐萝芙木HPLC 指纹图谱建立及利血平测定

唐 林 肖望重 刘 检 龙红萍 吴 笛 王宇红

（1.湖南中医药大学第一附属医院， 湖南长沙410007； 2.中药粉体与创新药物省部共建国家重点实验室培育基地， 湖南长沙410208）

夹竹桃科萝芙木属植物，全世界约135 个种和变种，其中研究较多的是萝芙木Rauvolfia verticillata（Lour.） Baill.、云南萝芙木Rauvolfia yunnanensisTsiang、催吐萝芙木Rauvolfia vomitoriaAfzel.及印度萝芙木Rauvolfia serpentine（L.）Benth.ex Kurz［1⁃2］。云南萝芙木具有清风热、降肝火、消肿解毒的功效，民间用于治疗高血压、眩晕、头痛、感冒发热、咽喉肿痛、痧症腹痛吐泻、风痒疥症、蛇伤等症［3］。该药主要分布于云南西南部地区，是我国重要的南药，也是比较稀缺的药用植物［4］。催吐萝芙木原产于西非加纳，1965 年从非洲引种至我国，以后开始在西双版纳及云南其他地区推广种植，是萝芙木属药材中的优良品种［5］。

云南萝芙木和催吐萝芙木均富含吲哚类生物碱，在降血压、抗心律不齐、抑制中枢神经系统等方面具有重要作用［6⁃7］，萝芙木属药材是降压药（如复方降压片、降压灵） 的重要天然来源。但目前关于萝芙木属药物的质量控制方面研究较少，主要以测定单一有效成分为主，缺乏整体性质量评价方法［8］。云南萝芙木与催吐萝芙木，2 种药材性状、产地、化学成分均相似，但药效毒理作用差别较大，因而亟需建立整体性评价方法加以比较和区分，以便指导合理用药。本实验采用HPLC 指纹图谱与化学模式识别相结合的方法对云南萝芙木与催吐萝芙木化学成分进行比较分析，以期为其质量控制提供实验依据。

1 材料

1260Ⅱ型高效液相色谱仪（二元泵，柱温箱，DAD 检测器）、1290UPLC⁃6540 accurate mass Q⁃TOF 色谱⁃质谱联用仪（配置Mass Hunter 质谱工作站）（美国Agilent 公司）；SK⁃7200HP 超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；Purelab Option Q15 超纯水机（法国Elga 公司）。甲醇、乙醇、三乙胺均为分析纯（上海国药集团化学试剂有限公司）；乙腈色谱纯（德国Merck 公司），自制双蒸水。利血平对照品（批号100041⁃201213，中国食品药品检定研究院）。

从云南各产地共收购和采集了15 批样品（11批云南萝芙木及4 批催吐萝芙木），信息见表1。药材经湖南中医药大学第一附属医院张志国教授鉴定为正品。

2 方法与结果

2.1 分析条件

2.1.1 色谱条件 C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈 （A） ⁃0.05% 三乙胺溶液（B），梯度洗脱（0～10 min，75%B；10～15 min，75%～60% B；15～25 min，60% B；25～40 min，60%～30%B；40～50 min，30%～10%B）；体积流量1 mL／min；检测波长280 nm；进样量10 μL。记录时间50 min。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

2.1.2 液质条件 Agilent Extend C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；流动相乙腈（A） ⁃0.1%甲酸胺（B），梯度洗脱（0～5 min，75%B；5～8 min，75%～60% B；8～13 min，60% B；13～20 min，60%～30%B；20～25 min，30%～10%B）；体积流量0.4 mL／min；进样量2 μL。记录时间25 min。电喷雾离子化 （ESI），准确质量数用ESI⁃L Low Concentration Tuning Mix （G1969⁃85000）校正，正离子分析模式，MRE 扫描方式扫描检测。m／z100～1 500，除溶剂气氮气；干燥气温度350 ℃；体积流量10 L／min；鞘气温度350 ℃；毛细管电压4.0 kV；Fragment 电压180 V；扫描范围为m／z100～1 700。

2.2 溶液制备

2.2.1 利血平对照品溶液制备 精密称取利血平对照品0.025 7 g，置于50 mL 量瓶中，加入甲醇适量溶解并定容，即得质量浓度为0.514 mg／mL的对照品贮备液。精密量取对照品贮备液1.0 mL，加入甲醇稀释定容至10 mL，得质量浓度为51.4 μg／mL 的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液制备 分别取云南萝芙木、催吐萝芙木粗粉适量，约1.5 g，精密称定，精密加入80% 乙醇25 mL，称定质量，超声 （250 W，50 kHz） 提取45 min，冷却至室温，再次称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 取同一供试品溶液，在“2.1.1” 项色谱条件下连续进样6 次，以利血平峰为参照峰（15 号峰），分别计算15 个共有色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，结果测得各共有峰相对保留时间RSD 为0.35%，相对峰面积RSD为0.72%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 稳定性试验 取同一批次云南萝芙木粗粉（批号S2），按“2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1” 项色谱条件下，分别于0、2、4、8、12、24 h 进样测定，以利血平峰为参照峰（15 号峰），分别计算15 个共有色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，结果测得各共有峰相对保留时间RSD 为0.43%，相对峰面积RSD 为0.98%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.3.3 重复性试验 取同一批次云南萝芙木粗粉（批号S2），共6 份，分别按照“2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1” 项色谱条件下进样分析。以利血平峰为参照峰（15 号峰），分别计算15 个共有色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，结果测得各共有峰相对保留时间RSD 为0.41%，相对峰面积RSD 为1.24%，表明该方法重复性良好。

2.4 云南萝芙木与催吐萝芙木指纹图谱建立

2.4.1 共有峰标定 分别取15 批样品粗粉，分别按“2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样检测。采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012） ” 对15 批样品HPLC图谱进行处理分析，采用多点校正法建立指纹图谱，选择中位数法计算得出对照图谱（R），见图1。选择图谱中含有量较大、分离较好且稳定的15号峰（利血平） 作为参比峰（S 峰），共标定15个共有峰作为共有特征峰。计算15 批样品各色谱峰相对保留时间与相对保留峰面积，结果显示，15批样品各共有峰相对保留时间RSD 为0.54%，表明各共有峰的出峰时间相对稳定。但各共有峰相对保留峰面积RSD 相差较大，表明不同批次药材各成分含有量存在一定差异。

图1 15 批样品HPLC 指纹图谱Fig.1 HPLC fingerprints of fifteen batches of samples

2.4.2 色谱峰指认 为了尽可能多地了解HPLC指纹图谱中各成分的化学结构信息，在“2.1.2项” 条件下，对供试品溶液进行分析，根据各色谱峰在正离子模式下获得的准分子离子（M＋H）＋，并结合相关文献［9⁃11］对图谱中15 个共有特征峰的可能化学结构进行推测，结果见表2。

表2 指纹图谱共有峰指认Tab.2 Common peak identification of fingerprints

2.4.3 相似度分析 采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012A） ” 对15 批样品进行相似度分析。相似度分别为0.95、0.95、0.95、0.85、0.95、0.94、0.92、0.94、0.83、0.95、0.97、0.96、0.97、0.88、0.85。实验发现催吐萝芙木（S4、S9、S14、S15） 与共有模式对照图谱的相似度范围在0.83～0.85，云南萝芙木各批次（S1、S2、S3、S5、S6、S7、S8、S10、S11、S12、S13）与共有模式对照图谱的相似度范围为0.92～0.97，结果表明云南萝芙木与催吐萝芙木在共有峰化学成分含有量上存在较大差异。

2.5 化学模式识别

2.5.1 聚类分析 以指纹图谱中标定的15 个共有峰的相对峰面积为变量，采用SPSS 22.0 软件中的平方Eudidean 距离对15 批样品进行系统聚类分析，结果见图2。根据聚类分析结果，将15 批样品大致分为两类，S4、S9、S14、S15 归为一类，属于催吐萝芙木，S1、S2、S3、S5、S6、S7、S8、S10、S11、S12、S13 归为一类，属于云南萝芙木。该分析与相似度评价结果一致。

图2 15 批样品聚类树状图Fig.2 Dendrogram of fifteen batches of samples

2.5.2 主成分分析 对15 批样品进行主成分分析，以指纹图谱中标定的15 个共有峰相对峰面积为自变量，以不同批次云南萝芙木（催吐萝芙木）为因变量，采用Simca13.0 软件进行数据分析，从主成分分析模式图见图3，样品S4、S9、S14、S15属于一类，样品S1、S2、S3、S5、S6、S7、S8、S10、S11、S12、S13 在平面图上属于另一类，该现象与聚类分析结果一致。

图3 15 批样品主成分分析图Fig.3 Principal component analysis plot for fifteen batches of samples

2.5.3 正交偏最小二乘法⁃判别分析（OPLS⁃DA） 为了进一步区分云南萝芙木与催吐萝芙木，并寻找二者之间的差异化合物，进一步采用有监督的OPLS⁃DA 对萝芙木属药材进行分析。以15 个共有峰的峰面积作为输入变量，以11 批云南萝芙木样品和4 批催吐萝芙木样品为输出变量进行OPLS⁃DA 分析。采用 Simca13.0 软件建立OPLS⁃DA 模型。由OPLS⁃DA 得分图见图4，该结果与主成分分析结果相似，15 批样品可以很好地被分为两类，即云南萝芙木与催吐萝芙木。进一步对2 组数据的差异性进行整体分析，得到变量权重重要性排序（VIP） 的预测值见图5，在0.95 的置信区间内，选取VIP ＞1.5 的化合物作为差异性标志物，差异性色谱峰为F15 与F7，即为利血平与萝芙木碱。

图4 15 批样品OPLS⁃DA 得分散点图Fig.4 OPLS⁃DA score scatter plot of fifteen batches of samples

图5 15 批样品主要色谱峰VIP 值Fig.5 VIP plot of chromatographic peaks in fifteen batches of samples

2.5.4 云南萝芙木与催吐萝芙木指纹图谱直观比较 通过对15 批样品（云南萝芙木、催吐萝芙木） 指纹图谱进行比较，结果见图6，15 个共有峰反映出两者的主要成分基本一致，但各共有峰的相对峰面积存在一定差异。催吐萝芙木较云南萝芙木在保留时间21.5、36.9、38.5 min 处存在较明显的差异成分，通过液质分析及文献研究，发现此3 峰分别可能为催吐萝芙木勒宁 （m／z350.164 2）［11］、利血胺 （m／z634.289 0）［10⁃11］、carapanaubine （m／z428.194 5）［10］。而云南萝芙木较催吐萝芙木在保留时间22.5、28.9、29.6 min处也存在差异成分，通过液质分析及文献研究，发现此 3 峰 分别可能为 raucaffricine （m／z512.216 5）［12］、匹克拉林碱（m／z410.184 2）［11］、ajmaline⁃O⁃hexoside （m／z488.252 4）［10］。

图6 云南萝芙木与催吐萝芙木指纹图谱比较Fig.6 Comparison of fingerprints chromatogram of R.Yunnanensis and R.vomitoria

2.6 利血平含有量测定

2.6.1 线性关系考察 精密量取利血平对照品贮备液适量（C对＝0.514 mg／mL），按一定比例制备成6 个质量浓度的系列混合对照品溶液，在“2.1.1” 项色谱条件下进样，测定峰面积。以峰面积为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X），进行回归，得方程为Y＝9 376.3X（r＝0.999 9），表明利血平在0.257～5.14 μg 范围内线性关系良好。

2.6.2 重复性试验 取同一批样品粉末（批号S2），共6 份，分别按“2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1” 项色谱条件下进样，结果测得利血平含有量RSD 为1.52%，表明该方法重复性良好。

2.6.3 加样回收率试验 取同一批样品（批号S2） 约0.7 g （每1 g 中含利血平0.46 mg），精密称定，共6 份，分别精密加入利血平对照品贮备液（C对＝0.514 mg／mL） 0.7 mL，按“2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1” 项色谱条件下测定，结果见表3。

2.6.4 样品含有量测定 分别取15 批样品粉末，按“2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进行测定，计算样品中利血平含有量，结果见图7。结果表明云南萝芙木（S1、S2、S3、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11、S12、S13）中利血平含有量约为0.3～0.6 mg／g，催吐萝芙木（S4、S9、S14、S15） 中利血平含有量约为1.7～1.8 mg／g，催吐萝芙木中利血平含有量明显高于云南萝芙木，约为云南萝芙木利血平含有量的3～4 倍。

表3 利血平加样回收率实验结果（n＝6）Tab.3 Results of recovery tests for reserpine （n＝6）

图7 15 批样品利血平含有量测定结果Fig.7 Results of content determination of reserpine in fifteen batches of samples

3 讨论

本实验采用二极管阵列检测器对云南萝芙木样品进行全波长扫描，比较了不同波长下 （280、254、210、230、310 nm） 色谱图的色谱峰数目与分离度。结果表明，在280 nm 波长下云南萝芙木样品的峰数目较多且分离度良好，因此检测波长为280 nm。另外，还分别考察了不同提取溶剂（甲醇、乙醇、80% 乙醇、80% 甲醇、三氯甲烷）、不同提取方法（超声法、水浴回流法）、不同提取时间（30、45、60 min） 对有效成分提取率的影响，结果表明80%甲醇超声45 min 指纹图谱不同成分提取率最高。

萝芙木属药材主要成分为生物碱，除了替巴因和罂粟碱为非吲哚类生物碱之外，其余89 种均为吲哚类生物碱，包括利血平、育亨宾等［7，13⁃14］，其中含有量较高并具有经济开发价值的主要有利血平、育亨宾、蛇根碱等［15⁃16］。虽然云南萝芙木与催吐萝芙木化学成分非常相似，但采用相似度评价、聚类分析、主成分分析、最小偏二乘法回归分析与指纹图谱相结合的方法［17⁃19］，不仅能体现整体质量，也可有效区分云南萝芙木与催吐萝芙木，以期为萝芙木属药材的质量控制提供实验依据，同时为多基源、多产地中药的质量标准研究提供新思路。

为了更好的辨识云南萝芙木与催吐萝芙木之间的质量差异，本实验采用OPLS⁃DA 筛选出云南萝芙木与催吐萝芙木指纹图谱共有峰中质量差异峰2个，其中之一通过对照品指认确定为利血平，另一个通过文献研究、液质分析推测其可能为萝芙木碱；此外，通过直观比较萝芙木与催吐萝芙木指纹图谱的差异，发现除去共有峰外两者均还存在差异性成分，并通过液质分析与文献对比对其可能成分进行初步指认，但还有待后续进一步验证。通过比较云南萝芙木与催吐萝芙木药材中利血平的含有量，发现催吐萝芙木中利血平含有量远远高于云南萝芙木，提示其可以作为两者鉴别的重要依据。因此，建议在云南萝芙木与催吐萝芙木质量控制方面，可重点关注以上差异性成分的含有量变化，从而更加快速、科学、准确地评价云南萝芙木与催吐萝芙木药物的质量。