安胰颗粒对SAP 大鼠胰腺组织NF⁃κB、iNOS、COX⁃2 表达的影响

2020-09-15边志远廖健思尹胡海田玉玲雷力民

中成药 2020年8期

文玲边志远廖健思尹胡海田玉玲雷力民*

（1.广西中医药大学，广西南宁530001； 2.广西中医药大学附属瑞康医院，广西南宁530011）

重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）是临床内科诊疗疾病中常见的需要长期治疗及有着高死亡率的急危重症，总体病死率高达20%～30%［1］。起病早期可发生全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），随后导致多器官功能障碍综合征（multiple organ syndrome，MODS）［2］。研究表明SAP 发病机制与细胞因子存在强相关性，细胞因子不仅参与炎症反应，同时可激活胰腺组织信号通路而参与胰腺微循环改变过程。核因子⁃κB （nuclear factor⁃κB，NF⁃κB）作为首动因子与多种细胞因子具有上下游关系。当NF⁃κB 被不适当激活而异常增高时，一方面引起肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白细胞介素（interleukin，IL）等炎症因子基因转录后大量表达［3］，引发SIRS；另一方面通过一系列联级反应放大刺激诱导型一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、环氧合酶⁃2（cyclo⁃oxygenase，COX⁃2）等血管微循环相关因子快速表达而发生胰腺微循环障碍导致MODS 走向死亡。本研究从核因子层面出发，探讨NF⁃κB／iNOS⁃COX⁃2 信号通路对SAP 时胰腺微循环的影响及安胰颗粒治疗SAP 的作用机制。

1 材料

1.1 动物清洁级雄性健康SD 大鼠120 只，体质量200～250 g，购自广西医科大学实验动物中心［动物生产许可证号SCXK （桂） 2017⁃0002］。

1.2 药物和试剂安胰颗粒［4］由大承气汤化裁，主要含有生大黄、玄明粉、甘遂、红藤、莪术等，由广西中医药大学监制，江阴天江药业有限公司调配颗粒制剂（批号1207303）；白介素⁃10 （rh IL⁃10，美国 PeproTech 公司）；左旋精氨酸（L⁃arginine，北京索莱宝科技有限公司）；EDTA（pH＝9.0）抗原修复液（武汉赛维尔生物科技有限公司，货号G1203）；TRIzol 试剂（美国Thermo Fisher 公司，货号15596⁃026）；RNase 抑制剂（美国ABI 公司，货号N8080119）；逆转录试剂盒（美国Thermo Fisher 公司，货号K1622）；PCR 检测试剂盒（德国Qiagen 公司，货号208054）；苏木素染液（武汉赛维尔生物科技有限公司，货号G1004）；HRP 标记山羊抗大鼠IgG （武汉赛维尔生物科技有限公司，货号GB23302，稀释比1 ∶200）；组化试剂盒DAB 显色剂（武汉赛维尔生物科技有限公司，货号G1211）。

1.3 仪器 OCT 包埋剂（日本Sakura 公司）；ABI 7500 实时荧光定量PCR 仪（美国ABI 公司）；台式高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；包埋机（武汉俊杰电子有限公司）；病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）；脱色摇床（武汉赛维尔生物科技有限公司）；成像系统、正置荧光显微镜（日本尼康公司）。

2 方法

2.1 分组、造模及给药大鼠适应性喂养3 d，随机分为正常组、模型组、IL⁃10 干预组、安胰颗粒组。大鼠造模前禁食12 h，不禁水，左旋精氨酸（生理盐水配成6%溶液）按150 mg／100 g 给药剂量每隔1 h 腹腔注射1 次，共3 次，诱导SAP 模型［5⁃6］。IL⁃10 干预组造模前1 次给予rh IL⁃10 10 000 U预处理后诱导SAP；安胰颗粒组造模前给予安胰颗粒（8 g／kg）进行灌胃，连续预给药3 d后诱导SAP；正常组和模型组予适量生理盐水灌胃。

2.2 样本采集各组于造模后3、6、12 h 时间点腹腔注射10% 水合氯醛（0.4 mg／g），麻醉大鼠，开腹见不同程度血性腹水，肉眼见胰腺组织水肿、出血或色苍白坏死。摘取胰头组织，一部分用于mRNA 提取（存于液氮），一部分用于病理学评分及免疫组化检查（4%中性甲醛固定）。

2.3 胰腺组织NF⁃κBmRNA 测定引物由赛默飞公司设计，引物序列见表1。TRIzol 法提取样本总RNA，取2 μg RNA 进行去DNA 处理，采用Thermo 试剂盒进行逆转录，再取逆转录好的cDNA 作为模板进行RT⁃PCR 检测，反应条件为95 ℃，2 min；95 ℃，5 s；60 ℃，30 s，共40次循环。以β⁃actin为内参，采用2-ΔΔct法进行数据分析。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

2.4 胰腺组织病理切片取各组的部分胰腺组织，解冻并脱水，石蜡包埋成功后切为多个5 μm 样本切片，经展片及烤片后脱蜡并分别进行苏木素及伊红染液染色，冲洗、脱水、脱蜡、风干封片后在光学显微镜下取10 个视野摄片保存。经病理学评分后显示造模成功。

2.5 胰腺组织iNOS、COX⁃2 测定取4%中性甲醛固定的样本，切取所需部位组织块按常规步骤脱水浸蜡包埋及切片，展片、捞片、控片、烤片处理后对组织切片进行浸泡、修复、孵育、DAB 显色、苏木素染色、脱水等处理后封片保存，拍照，采用免疫组化累积光密度值（IOD）分析方法（每组内每张切片随机挑选至少3 个200 倍视野进行拍照），将相同的黄棕色判读为阳性作为选择标准，用Image⁃Pro Plus 6.0 进行分析，计算每张照片阳性的累积光密度值。

2.6 统计学分析采用SPSS 22.0 软件进行统计分析，计量资料以（）表示。正态分布且方差齐时，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD 法；不满足正态分布或方差不齐时，采用Kruskal⁃Wallis 非参数检验并作组间多重比较。按α ＝0.05检验水准。

3 结果

3.1 胰腺组织损伤及病理学观察正常组见正常白色胰腺组织，无明显腹水，病理标本见完整胰腺小叶及腺泡结构。模型组开腹见大量深红色血性腹水，腹水量随时间增加而增加，胰腺组织模糊不清呈暗红色，伴渗血或坏死；病理下见胰腺小叶、腺泡、细胞间隙增宽，胰腺小叶结构改变，大量炎症细胞浸润，腺泡肿胀、空泡化、坏死，且发生时间早。IL⁃10 干预组及安胰颗粒组开腹见红色血性腹水，腹水量较模型组少，胰腺组织水肿呈苍白色或见点状出血，胰腺边界模糊；病理下见胰腺小叶轻度水肿、间隙增宽、灶性或点状坏死，其水肿、变性坏死、炎症细胞浸润程度较模型组减轻。各组病理切片见图1。

图1 造模后6 h 各组大鼠胰腺组织病理学（HE，×200）Fig.1 Image of pancreatic histopathology of each group six hours after modeling （HE，×200）

3.2 胰腺组织NF⁃κBmRNA 表达检测左旋精氨酸诱导SAP 模型3、6、12 h 后，模型组胰腺组织NF⁃κBmRNA 表达均升高（P＜0.01）；经IL⁃10 及安胰颗粒干预后，NF⁃κBmRNA 表达降低（P＜0.05）；IL⁃10 干预组及安胰颗粒组各时间点比较，差异无统计学意义，见表2。尚不能认为安胰颗粒组抑制NF⁃κBmRNA 表达能力较IL⁃10 干预组佳。

表2 安胰颗粒对胰腺组织NF⁃κB mRNA 表达的影响（， n＝10）Tab.2 Effects of Anyi Granules on pancreatic expression of NF⁃κB mRNA（，n＝10）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05。

3.3 胰腺组织iNOS 的表达检测左旋精氨酸诱导SAP 模型3、6、12 h 后，模型组大鼠胰腺组织iNOS 表达升高（P＜0.01）；经IL⁃10 及安胰颗粒干预后，iNOS 表达降低（P＜0.01）；IL⁃10 干预组及安胰颗粒组各时间点比较，差异无统计学意义，见表3。尚不能认为安胰颗粒组抑制iNOS 的表达能力较IL⁃10 干预组佳。各组胰腺组织iNOS 第12 小时的免疫组化见图2。

表3 安胰颗粒对胰腺组织iNOS 表达的影响（， n＝10）Tab.3 Effects of Anyi Granules on pancreatic iNOS expression （， n＝10）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，△△P＜0.01。

图2 免疫组化检测造模后12 h 各组胰腺组织iNOS、COX⁃2 表达（×200）Fig.2 Detection of pancreatic iNOS and COX⁃2 expression of each group twelve hours after modeling by immunohistochemical （×200）

3.4 胰腺组织COX⁃2 的表达检测左旋精氨酸诱导SAP 模型3、6、12 h 后，模型组胰腺组织COX⁃2表达升高（P＜0.01），且12 h 达到高峰；经IL⁃10 及安胰颗粒干预后，COX⁃2 表达降低（P＜0.01）；IL⁃10 干预组及安胰颗粒组各时间点比较，差异无统计学意义，见表4。尚不能认为安胰颗粒组抑制COX⁃2 的表达能力较IL⁃10 干预组佳。各组胰腺组织COX⁃2 第12 小时的免疫组化见图2。

表4 安胰颗粒对胰腺组织COX⁃2 表达的影响（， n＝10）Tab.4 Effects of Anyi Granules on pancreatic COX⁃2 expression （， n＝10）

注：与正常组比，**P＜0.01；与模型组比较，△△P＜0.01。

4 讨论

炎性浸润及微循环障碍同时影响SAP 进程及预后，众多研究已表明炎症因子参与SAP 的发生，但从微循环角度研究尚有不足，本实验从NF⁃κB对其下游因子iNOS、COX⁃2 影响的角度阐明SAP时发生微循环障碍的可能机制。NF⁃κB［7⁃9］是人体中普遍存在的核转录因子，通常存在于细胞质且无活性，SAP 时NF⁃κB 受到刺激后迅速激活并移至细胞核中，易位过程中介导众多炎症基因的表达，进一步激活促炎细胞因子、趋化因子、黏附分子及包括iNOS、COX⁃2 在内的诱导酶等，而这些因子或酶的表达又进一步激活更多的NF⁃κB，如此循环往复，炎症反应及微循环障碍持续加重。本实验中，模型组造模后3 h NF⁃κB 表达明显升高，12 h达到本实验观察的峰值，表明NF⁃κB 在SAP 开始的12 h 内呈递增趋势。一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）广泛存于内皮细胞、巨噬细胞、血小板和胰腺中，在分子水平上调控NO 合成。其分为3 种亚型［10］，其中神经型和内皮型在细胞及组织中持续存在但只生成极少量的NO；诱导型只有在如NF⁃κB 的下游因子（肿瘤坏死因子、白介素1、干扰素⁃α 等）刺激下才生成，诱导型NOS的生成能刺激产生大量的NO。NO 是一种参与微循环和炎症反应的高活性自由基，在机体中不仅是一种信号分子也是内毒素或促炎细胞因子，与SAP的严重程度密切相关［3］。SAP 过程中，iNOS 生成增加引起NO 过度表达，造成胰腺微血管难治性扩张，血流瘀滞，胰腺微循环缺血，同时引起的胰腺缺血⁃再灌注损伤过程中生产大量氧自由基，直接损害包括胰管内皮细胞在内的胰腺微循环血管系统，引起严重的微循环障碍［11⁃13］。本实验发现模型组iNOS 的表达明显升高，进一步证实iNOS 与SAP 的密切关系。COX⁃2 是花生四烯酸转化为前列环素、血栓素和前列腺素等生理活性类花生酸的限速酶，在机体正常情况下在组织中不可测或表达极少，只有炎症发生时才会表达，因此其异常表达与炎症轻重程度密切相关［14］。SAP 过程中，NF⁃κB 可诱导COX⁃2 生成，COX⁃2 的代谢产物中前列腺素E2 （prostaglandin，PGE2）在炎症、胰岛破坏和抑制胰岛素分泌中起着关键作用［15⁃16］。COX⁃2亦可刺激NO 生成增多，协同前列腺素直接影响胰岛细胞增殖、分化和血管生成，加快胰岛细胞凋亡而使胰腺微循环障碍进一步加重［17⁃18］。NO 还可增强COX⁃2 的活性，二者在相关研究的免疫反应性评分中表现出显著相关性［18］，在SAP 中协同发挥作用，共同参与并加重胰腺微循环障碍。

安胰颗粒是以大承气汤加减理气止痛、清热解毒、活血祛瘀等药而成。SAP 早期即可出现微循环障碍，而轻症胰腺炎中并不明显，因此安胰颗粒特别选择了甘遂、红藤、莪术三药，轻症胰腺炎则不用，是安胰颗粒临床应用加减使用的特点。而红藤、莪术用于重症急性胰腺炎的文献鲜见，红藤功效清热解毒、活血止痛、治肠痈腹痛要药，莪术破血祛瘀、行气止痛，二药主要针对重症胰腺炎热毒血瘀互结的病理本质所用。方中红藤通过调节NF⁃κB信号通路，抑制细胞因子TNF⁃α、IL⁃1β、IL⁃10 的分泌，下调血栓素2 水平及血栓素2 与前列环素2 的比值等来抑制或延缓炎症反应及损害，改善血管通透性以达到有效的抗炎抗凝作用［19⁃22］。莪术可有效降低NF⁃κB 的表达来减少血管内皮因子（如NO）的表达，NO 生成的减少既能缓解血液粘稠易凝状态，还能较好的抑制COX⁃2，以减少其下游的PGE2介导的炎症免疫反应，达到缓解SAP 病情的目的［23⁃27］。安胰颗粒的配伍特点对于SAP 不仅清热通腑、理气止痛，更有活血祛瘀之功，为其能有效治疗SAP 提供进一步的可靠证据。在本实验中，由左旋精氨酸诱导的SAP 在经过安胰颗粒灌胃预处理3 d 后，水肿、炎性浸润、细胞损伤及胰腺出血坏死较模型组明显减轻，胰腺组织中NF⁃κB、iNOS、COX⁃2 表达也明显下降，表明安胰颗粒可能通过抑制三者的表达以减轻SAP 时的炎症反应及微循环障碍程度。

本实验表明，SAP 发生时核因子⁃κB 大量表达，iNOS、COX⁃2 表达也显著增加，安胰颗粒能显著降低SAP 大鼠胰腺组织NF⁃κB、iNOS、COX⁃2表达，通过阶梯性降低细胞因子的表达而改善胰腺微循环障碍的严重程度从而达到治疗SAP 的目的。