车前子对原发性高血压大鼠的降压作用

兰继平 张洁玉 童仁超李 娜李 纬李亚娟王峥涛杨 莉*

（1.上海中医药大学中药研究所， 中药标准化教育部重点实验室， 上海201203； 2.上海中医药大学交叉科学研究院， 上海201203）

高血压（Hypertension） 是最常见的心血管疾病之一，它是以体循环动脉压增高为主要表现，可伴有心、脑、肾等器官功能或器质性损害的临床综合征，可导致脑卒中、冠心病等，在临床上有高致残率和高致死率的特点［1⁃2］。随着社会工作频率和生活节奏的加快，高血压的发病率已在逐年上升。据报道，目前我国18 岁及以上成人高血压患病率为25.2%［3］。目前临床上用于治疗高血压的药物有很多种，但都存在着局限性，长期服药甚至有着明显的不良反应［4］。而中药因其成分的多样性而具有的多环节、多途径、多靶点的作用特点在治疗高血压方面受到越来越多人的关注［5］。

车前子为车前科车前属植物车前Plantago asiaticaL.或平车前Plantago depressaWilld.的干燥成熟种子，有清热利尿、渗湿通淋、明目祛痰等功效。现代研究表明车前子具有治疗高血压、糖尿病和机体脂质紊乱的作用［6］。本实验以车前子为研究对象，以原发性高血压大鼠（Spontaneous Hy⁃pertension Rat，SHR） 为模型，探讨车前子对SHR高血压的作用，通过对肾素⁃血管紧张素⁃醛固酮系统（Renin⁃Angiotensin⁃Aldosterone System，RAAS）和血管相关功能的研究，探讨其可能的降血压途径。

1 材料

1.1 药物与试剂 车前子药材 （批号1212030642，产地江西） 购自上海康桥药业有限公司，由上海中医药大学中药所吴立宏副研究员鉴定为正品。福辛普利钠片（国药准字H20023371）购自中美上海施贵宝制药有限公司生产；氯化镁（批号20140821）、碳酸氢钠（批号201401201）、氯化钙 （批号 201201025）、葡萄糖 （批号20160322）、95%乙醇，购自国药集团上海化学试剂有限公司；水为自制蒸馏水。苯肾上腺素（Phe⁃nylephrine，PE，批号P6126）、乙酰胆碱（Acetyl⁃choline，ACH，批号A6625）、硝普钠（Sodium ni⁃troprusside，SNP，批号 SN⁃60Q91） 购自美国Sigma 公司。肾素（Renin，批号EL160617）、血管紧张素Ⅱ （Angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ，批号EL161117）、血管紧张素转化酶（Angiotensin con⁃verting enzyme，ACE，批号EL170218）、醛固酮（Aldosterone，ALD，批号EL170618） 酶联免疫试剂盒购自广州瑞博奥生物科技有限公司；内皮素⁃1（Endothelin⁃1，ET⁃1，批号SBJ⁃R0140）、内皮型一氧化氮合酶 （Endothelial nitric oxide synthase，eNOS，批号SBJ⁃T0017） 酶联免疫试剂盒购自南京森贝伽生物科技有限公司。

1.2 仪器 ALC⁃NIBP 大鼠无创血压测量分析系统（上海奥尔科特生物科技有限公司）；BH2 型光学显微镜（日本奥林巴斯株式会社）；ML740 型PowerLab／4SP 生物信号处理和分析系统（澳大利亚ADInstruments 公司）；恒温平滑肌浴槽为上海中医药大学中药研究所自制；744 型PH 计［瑞士Metrohm （万通） 公司］；RH⁃KT／C 型磁力搅拌器［广州爱卡仪器设备（IKA） 公司］。

1.3 动物 8～12 周龄清洁级雄性SHR 和Wistar⁃Kyoto （WKY） 大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号SCXK （京）2016⁃006，饲养于上海南方模式生物中心清洁级屏障动物房标准鼠笼，动物进食进水不限，光照周期12 h／12 h，室温22～23 ℃，相对湿度45%～50%。相关动物实验过程符合动物伦理委员会的要求。

2 方法

2.1 药物制备 取车前子适量，加入10 倍量95%乙醇，热回流提取2 h，提取3 次，合并提取液，50 ℃减压回收溶剂，冷冻干燥得到车前子干燥浸膏。4 ℃密封保存，临用时取适量浸膏制成0.13 g 生药／mL溶液。阳性药溶液，取福辛普利钠片2 粒（含福辛普利钠，10 mg／片），研碎，溶于40 mL 蒸馏水中，得到质量浓度为0.5 mg／mL 福辛普利钠溶液。

2.2 配置Krebs⁃Henseleit （K⁃H） 溶液 在磁力搅拌器下，2 L 双蒸水中依次加入氯化钠13.792 g、氯化钾0.701 g、氯化钙0.566 g、硫酸镁0.284 g、磷酸二氢钾0.321 g、碳酸氢钠4.180 g、葡萄糖4.399 g （为避免形成难溶物使溶液浑浊，应在上1个化合物完全溶解后再加下1 个化合物），充分搅拌溶解后，用稀盐酸调节pH 至7.40 左右，即得。

2.3 配置氯化钾溶液 在磁力搅拌下，在1 L 水中分别加入氯化钠36.64 g、氯化钾44.73 g、磷酸二氢钾1.632 g、碳酸氢钠21.004 g、充分溶解得到高浓度氯化钾母液。取高浓度氯化钾母液50 mL，氯化钙0.184 g，氯化镁0.122 g，葡萄糖1.0 g，加入到450 mL 纯水中充分溶解摇匀，调节pH 到7.4，即得。

2.4 分组 选用8～12 周龄雄性SHR 24 只和WKY 大鼠8 只，适应性喂养7 d。利用大鼠无创血压仪测量每只SHR 血压，将SHR 随机分为模型组、阳性药组（2.5 mg／kg）、车前子组（1.3 g 生药／kg），WKY 大鼠作为正常组，每组8 只。各组大鼠按5 mL／kg 灌胃给药，每日1 次，连续8 周，其中正常组和模型组给予相同体积蒸馏水。每2 周采用ALC⁃NIBP 大鼠无创血压测量分析系统测定各组大鼠尾动脉压。动物禁食不禁水8 h，腹腔注射20%乌拉坦麻醉（7 mL／kg），腹主动脉收集血液，迅速分离主动脉弓下约1 cm 处长约1.2 cm 的胸主动脉，置于K⁃H 液平皿中，待做后续处理。

2.5 动脉血管环舒缩功能测定 大鼠离体动脉血管环的制备，将置于4 ℃预冷、预氧饱和的K⁃H液中的动脉条，在显微镜下小心清除血管表面多余组织后，每根动脉剪约3 mm 长的血管环2 根，将血管环置于盛有37 ℃恒温K⁃H 液（4 mL） 中，并持续通入95%氧气、5%二氧化碳的混合气体的麦氏浴槽中，每个血管环用2 个L 型不锈钢小钩小心贯穿入血管环的腔管，一段固定在浴槽底端，另一端通过丝线连接张力换能器，张立的变化传输并计入在PowerLab／4SP 生物信号记录分析系统。

动脉血管环张力的测定，制备好的血管环固定在浴槽，给予2 g 张力（静息张力） 并稳定平衡60 min，每20 min 换1 次K⁃H 液。血管环张力稳定之后，弃去K⁃H 液，加入已在37 ℃预热的氯化钾溶液，20 min 达到稳定之后，记录数据，弃去氯化钾溶液，重新换上37 ℃预热的K⁃H 液，血管舒张达到稳定之后再次换上37 ℃预热的氯化钾溶液，血管收缩达到稳定之后计入数据，再次换上37 ℃预热的K⁃H 液。稳定之后，以累计浓度的PE （1×10-10、1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5mol／L） 作用于动脉血管环上，每个浓度作用至平衡，大约时间为5 min，以最后1 次K⁃H 液的稳定值为基准值，记录加入PE 稳定时的数据。后弃去浴槽内液体，用K⁃H 也重新平衡3 次，20 min／次。最后一次平衡之后，加入10-6mol／L 浓度的PE 刺激血管环，使血管收缩达到最大幅度，再先后给予累计浓度的ACH （1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5mol／L） 作用于动脉血管环，引起血管舒张，每个浓度作用5 min。最后稳定在最后1 个ACH 浓度时加入10 μL SNP，平衡时记录数据。

以血管环在10-6mol／L 浓度PE 达到的最大收缩幅度和加入SNP 稳定的舒张幅度之间的差值作为100%，将各浓度ACH 引起的舒张反应与最大收缩幅度比较，计算出各自的舒张百分值，绘制量⁃效曲线。本实验在上海中医药大学穆拉德中心实验室完成。

2.6 检测生化指标 按酶联免疫试剂盒所述方法分别测定并计算血清中Renin、ALD、ACE、AngⅡ、eNOS 和ET⁃1 的水平。

2.7 统计学分析 应用GraphPad Prism 7 软件进行统计，数据以（） 表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组比较比较采用t检验。以P≤0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 车前子对SHR 血压的影响 如表1 所示，除正常组外，模型组和各给药组大鼠在给药前血压均大于160 mmHg；给药2 周后，模型组血压上升至（184.59±3.16） mmHg，与模型组比较，车前子组血压下降（P＜0.001）；连续给药8 周后，车前子组与模型组（187.83±1.15） mmHg 相比下降幅度达到20 mmHg 左右（P＜0.01）。提示长期服用车前子可维持收缩压在较低的水平。

表1 各组给药8 周大鼠收缩压（mmHg，1 mmHg＝0.133 kPa，， n＝8）Tab.1 Systolic blood pressure of rats in each group after 8 weeks of administration in SHR （mmHg，1 mmHg ＝0.133 kPa，， n＝8）

表1 各组给药8 周大鼠收缩压（mmHg，1 mmHg＝0.133 kPa，， n＝8）Tab.1 Systolic blood pressure of rats in each group after 8 weeks of administration in SHR （mmHg，1 mmHg ＝0.133 kPa，， n＝8）

注：与正常组比较，＃＃P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01。

3.2 血清中RAAS 相关指标测定 如图1 所示，与正常组比较，模型组中调控血压升高相关指标ALD、Renin、ACE、Ang Ⅱ水平增加（P＜0.01）。给药8 周后，与模型组比较，车前子组中大鼠血清ALD、Renin、ACE、Ang Ⅱ水平下降（P＜0.05，P＜0.01）。表明车前子可通过调控RAAS 的紊乱，进而达到调控血压的目的。

图1 各组大鼠RAAS 的水平（n＝8）Fig.1 Levels of RAAS in each group （n＝8）

3.3 PE 作用于胸主动脉血管环收缩率 SHR 胸主动脉血管环收缩率比较，模型组收缩率在PE 浓度为1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5mol／L 时与正常组比较分别增强了438.0%、68.4%、32.6%和33.0%，均差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），表明模型组SHR 的胸主动脉的收缩明显增强。与模型组比较，车前子组在PE 浓度为1×10-6、1×10-5mol／L 收缩率分别减小了17.8%、18.1% （P＜0.01），表明车前子对这几个浓度PE引起的血管收缩上有抑制作用（P＜0.01）。结果见表2、图2。

表2 各组大鼠在不同PE 浓度下的血管环收缩率（%，， n＝8）Tab.2 Vascular ring contraction rate of rats in each group at different PE concentrations （%，， n＝8）

表2 各组大鼠在不同PE 浓度下的血管环收缩率（%，， n＝8）Tab.2 Vascular ring contraction rate of rats in each group at different PE concentrations （%，， n＝8）

注：与正常组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01。

图2 各组大鼠在不同PE 浓度下的血管环收缩率曲线（n＝8）Fig.2 Vascular ring contraction rate curves of rats in each group at different PE concen⁃trations （n＝8）

3.4 ACH 作用于胸主动脉血管环舒张率 与正常组比较，模型组胸主动脉血管环在1×10-8～1×10-5mol／L ACH 作用下，舒张率下降 （P＜0.05，P＜0.01），表明高血压大鼠血管的舒张受到明显的抑制。给药之后，与模型组比较，车前子组胸主动脉血管环在1×10-8、1×10-7、1×10-6mol／L ACH 作用下舒张率升高（P＜0.05），表明车前子能显著性的改善ACH 诱导的高血压大鼠血管舒张受抑制的情况。结果见表3、图3。

3.5 血清中eNOS 和ET⁃1 水平的测定 如图4 所示，与正常组大鼠比较，模型组大鼠中eNOS 和ET⁃1 的水平分别上升了17.1%、24.0%，均差异有统计学意义（P＜0.01）。给药后，与模型组相比，车前子组中模型大鼠血清中的eNOS、ET⁃1 水平分别降低了11.1%、30.5%，均差异有统计学意义（P＜0.05）。表明车前子可抑制SHR 中高表达eNOS、ET⁃1 水平，这可能是车前子能降低血压的途径之一。

表3 各组大鼠在不同ACH 浓度下的血管环舒张率（%，， n＝8）Tab.3 Vascular ring relaxation rate in each group at different ACH concentrations （%，， n＝8）

表3 各组大鼠在不同ACH 浓度下的血管环舒张率（%，， n＝8）Tab.3 Vascular ring relaxation rate in each group at different ACH concentrations （%，， n＝8）

注：与正常组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

图3 各组大鼠在不同ACH 浓度下的血管环舒张率曲线（n＝8）Fig.3 Vascular ring relaxation rate curves of rats in each group at different ACH concentrations （n＝8）

4 讨论

图4 给药后各组大鼠内皮相关功能指标水平（n＝8）Fig.4 Levels of endothelial⁃related function indexes after administration （n＝8）

RAAS 不仅在心血管系统的发育、血压和血容量的调节、以及心血管系统结构与功能的重塑方面起着重要作用，还与水盐代谢有着密切的联系，在人类高血压形成中起着至关重要的作用［7］。肾素是由肾小球细胞合成和分泌的一种酸性蛋白酶，通过肾静脉进入血液循环后，刺激使血中由肝生成的血管紧张素原（属α 球蛋白） 产生血管紧张素Ⅰ（AngI，10 肽），而Ang 在ACE 作用下变成AngⅡ（10 肽）［8］。AngⅡ是已知最强的缩血管活性物质之一，可作用于血管平滑肌，使全身微动脉收缩，动脉血压增高，另外AngⅡ促进ALD 的分泌，激活RAAS，引起血压升高［9］。AngⅡ不仅具有调节血管的收缩作用，并且和氧化应激和炎症因子息息相关［10］。在本实验中，车前子能显著降低SHR Renin、ACE、AngⅡ和ALD 的水平，从而达到降压的目的。

血管腔的大小由血管平滑肌的收缩状态决定，所以血管平滑肌的紧张程度异常增大参与了血管性疾病的发生机制［11］。其中Ca2＋和血管内皮细胞释放的一系列，如NO、前列腺素、超极化因子，作为关键性因子影响着血管平滑肌的舒缩。其中Ca2＋的影响主要源于它的内流和外流。Ca2＋的内流主要通过平滑肌细胞的电压依赖性Ca2＋通道和受体操纵性Ca2＋通道来完成的［12］。本实验结果显示，给予药物车前子之后，胸主动脉在PE 的刺激下的收缩明显得到了抑制，在ACH 的刺激下的舒张有明显的促进作用。结果表明车前子对于高血压大鼠的血管舒缩功能有着改善作用，这可能是车前子降血压作用的重要途径之一。

另外，血管内皮功能障碍在高血压的发病及其所致的慢性并发症中起重要作用。NO 和ET⁃1 之间复杂的相互作用可以促使血管内皮功能障碍的发生。ET⁃1 与血压水平呈正相关外，与靶器官损害程度呈平行关系，因此，ET⁃1 在高血压病及其并发症的诊断和疗效判定上有重大的意义。NO 是内皮细胞产生的具有可扩散性、扩张血管的一种物质，内皮细胞释放的NO 在生理状态下可使内皮下血管平滑肌细胞处于增殖静止状态从而达到抗血管壁增殖的作用［13⁃14］，因此对于血压的调控同样起着重要的作用。而给予药物车前子之后，模型大鼠中ET⁃1 和eNOS 的水平显著降低，表明调节内皮细胞功能亦是车前子降血压的重要途径之一。

综上所述，车前子对SHR 有着良好的降低血压作用，其对SHR RAAS 中紊乱Renin、ACE、AngⅡ、ALD 水平，血管舒张和收缩功能障碍以及血管内皮相关功能ET⁃1 和eNOS 紊乱的改善作用可能是降低血压的重要途径。