响应曲面法优化桑白皮中3个成分的提取工艺△

刘一涵，田云刚，王建霞，郭洪伟，魏华，2*

1.吉首大学 生物资源与环境科学学院，湖南 吉首 416000；2.湖南省土家医药研究中心，湖南 吉首 416000

桑白皮为桑科植物桑MorusalbaL.的干燥根皮，由秋末叶落时至次春发芽前采挖根部，刮去黄棕色粗皮，纵向剖开，剥取根皮，晒干后得[1]。桑白皮是一种被广泛用于治疗咳嗽、肝炎、糖尿病、心脏病及其他炎性疾病的传统药物[2]。现代药理研究表明，桑白皮具有抗炎、抗癌、降血脂、抗菌、抗糖尿病、胰脂肪酶抑制、神经保护、抗酪氨酸酶、抗氧化、抗抑郁等活性[2-4]。桑白皮中主要含有Diels-Alder型加合物、黄酮类、多羟基化生物碱、2-芳基苯并呋喃和二苯乙烯等成分[4]。桑酮G、桑酮H、桑辛素为桑白皮中的3个主要活性成分。桑酮G对口腔病原体如变形链球菌、血链球菌、链球菌等具有明显的抑制作用[3]；桑酮H具有抗人类免疫缺陷病毒(HIV)活性[5]；桑辛素具有抗癌、抗炎、抗惊厥、神经保护、抗氧化和抗HIV等活性[2]。桑酮G、桑酮H、桑辛素生物活性确切，但含量相对较少，其提取制备方法有待提高。为此，本研究采用响应曲面法中心组合设计试验，并结合HPLC测定含量，对桑白皮中的桑酮G、桑酮H、桑辛素进行提取工艺优化。与正交设计法相比，响应曲面法综合了试验设计与数学建模，可获得响应目标与试验因素之间明确的函数关系，从而获得较为精确的最佳工艺参数和响应目标的最优值[6]。因此，本实验结果具有一定的参考价值和实用价值。

1 材料

1.1 仪器

WJX-800A高速多功能粉碎机(上海缘沃工贸有限公司)；LE204E天平(METTLER TOLEDO公司)；SHIMADZU高效液相色谱，配备Essentia LC-16二元泵、Essentia SIL-16自动进样器、Essentia SPD-16检测器、Essentia CTO-16柱温箱以及Labsolution工作站(岛津公司，中国)；R-210旋转蒸发仪(BUCHI公司)；电热恒温水浴锅(北京市永光明医疗仪器有限公司)。

1.2 试药

桑酮G、桑酮H、桑辛素对照品为实验室自制，经HPLC检测，纯度分别为97%、98%、96%；乙腈(色谱纯，美国天地有限公司)；甲醇、无水乙醇、甲酸(分析纯，成都金山化学试剂有限公司)；水为怡宝纯净水。

桑白皮药材为市面购买，经吉首大学魏华副教授鉴定为桑科植物桑MorusalbaL.的根皮。

2 方法与结果

2.1 3个成分的含量测定

2.1.1色谱条件 色谱柱：WondaCr act ODS-2柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：0.2%甲酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0～27 min，44%B；27～28 min，44%～50%B；28～47 min，50%B，47～48 min，50%～55%B，48～70 min，55%B，70～71 min，55%～100%B，70～81 min，100%B，81～82 min，100%～44%B，82～90 min，44%B)；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：265 nm；柱温：40 ℃；进样量：10 μL。

2.1.2混合对照品的制备 精密称取桑酮H和桑辛素对照品7.2、4.7 mg，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，配制成质量浓度分别为720、470 μg·mL-1的桑酮H、桑辛素对照品母液。分别取4 mL桑酮H和5 mL桑辛素对照品母液于装有9.1 mg桑酮G对照品的25 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，最终得桑酮G 364 μg·mL-1、桑酮H 115.2 μg·mL-1、桑辛素94 μg·mL-1的混合对照品。

2.1.3供试品溶液的制备 精密称取药材粉末(过二号筛)0.500 g，置具塞锥形瓶中，精密加入不同浓度、不同体积的乙醇，回流提取，提取时间不同，提取温度不同，冷却后抽滤，滤液浓缩干后用80%甲醇定容至50 mL量瓶，充分摇匀，取适量过0.45 μm滤膜，即得供试品溶液。

注：A.桑酮G、桑酮H和桑辛素的混合对照品；B.桑白皮供试品溶液；1.桑酮G；2.桑酮H；3.桑辛素。图1 桑酮G、桑酮H和桑辛素的混合对照品及桑白皮供试品溶液的HPLC图

2.2 方法学考察

2.2.1线性关系考察 精密吸取混合对照品溶液，加甲醇稀释成7个质量浓度的对照品溶液，在2.1.1项下条件进样测定。以各成分峰面积为纵坐标(Y)，各组分浓度(μg·mL-1)为横坐标(X)绘制标准曲线，见表1。各成分在相应范围内线性关系良好。

表1 桑白皮3个成分的线性回归方程、线性范围

2.2.2仪器精密度 取同一浓度混合对照品溶液，重复进样6次，测得桑酮G、桑酮H、桑辛素峰面积的RSD分别为0.25%、0.27%、0.26%，保留时间的RSD分别为0.53%、0.37%、0.27%，表明仪器精密度良好。

2.2.3方法精密度 日内精密度：取同一浓度混合对照品溶液，连续进样6次，桑酮G、桑酮H、桑辛素峰面积的RSD分别为0.25%、0.27%、0.26%，保留时间的RSD分别为0.53%、0.37%、0.27%，表明日内精密的良好。

日间精密度：取同一浓度混合对照品溶液，重复进样6次，进样3 d，测定桑酮G、桑酮H、桑辛素峰面积的RSD分别为0.82%、1.07%、0.91%，保留时间的RSD分别为1.09%、0.66%、0.44%，表明日间精密度良好。

2.2.4重复性试验 取桑白皮药材6份，按2.1.3项下方法制备供试品溶液，按2.1.1项下方法测定，桑酮G、桑酮H、桑辛素峰面的RSD分别为1.76%、2.37%、3.46%，表明重复性良好。

2.2.5稳定性试验 取同一供试品溶液，室温下放置，按2.1.1项下方法，每隔3 h进一次样，持续24 h，测得桑酮G、桑酮H、桑辛素峰面积的RSD分别为0.74%、0.99%、0.76%，保留时间的RSD分别为1.11%、0.69%、0.48%，表明供试品在24 h内稳定性良好。

2.2.6加样回收率试验 取桑酮G、桑酮H、桑辛素对照品，分别加甲醇稀释成质量浓度为1.88、0.72、0.47 mg·mL-1的对照品溶液。精密称定已知含量的桑白皮样品0.250 g，按所取样品中3个成分已知含量的80%、100%、120%，取上述各对照品溶液于锥形瓶中，挥干甲醇后，加入称取样品，按2.1.3项下方法进行制备，按2.1.1项下方法测定，计算加样回收率。测定桑酮G、桑酮H、桑辛素的加样回收率，结果见表2。

表2 桑白皮中桑酮G、桑酮H和桑辛素的加样回收率试验结果(n=3)

2.3 单因素试验

根据表3，分别改变提取溶剂的乙醇体积分数、溶剂体积、提取温度及提取时间进行单因素试验，测定桑酮G、桑酮H、桑辛素的含量，考察各因素的影响，结果见图2。

表3 同步提取桑白皮中桑酮G、桑酮H和桑辛素的单因素试验设计

结果显示，随着乙醇体积分数增加，桑酮G、桑酮H和桑辛素含量逐渐上升，在60%处均达到最大，之后桑酮G和桑辛素含量呈缓慢下降趋势，桑酮H基本趋于平缓；液料比对桑酮H和桑辛素的提取含量影响均不明显，随着液料比从10∶1增加到14∶1，桑酮G含量逐渐上升达到最大值，在14∶1以后，桑酮G含量稍有下降，后趋于平缓；随着提取温度升高，桑酮G含量明显增加，桑酮H和桑辛素含量缓慢增加，到60 ℃达到最大，后三者呈缓慢降低趋势；在提取80 min时三者含量均达最大。

注：A.乙醇体积分数对桑白皮中桑酮G、桑酮H、桑辛素提取量的影响；B.液料比对桑白皮中桑酮G、桑酮H、桑辛素提取量的影响；C.提取温度对桑白皮中桑酮G、桑酮H、桑辛素提取量的影响；D.提取时间对桑白皮中桑酮G、桑酮H、桑辛素提取量的影响。图2 各因素对桑酮G、桑酮H、桑辛素提取量的影响

2.4 响应曲面试验设计

2.4.1试验因素与水平设计 根据单因素试验结果，综合考虑乙醇浓度、液料比、提取温度、提取时间对桑酮G、桑酮H、桑辛素含量的影响，选择以乙醇体积分数(A)、提取温度(B)和提取时间(C)为主要考察因素，自变量的高低水平用1、0、-1表示，分别以桑酮含量(Y1)、桑酮H含量(Y2)、桑辛素含量(Y3)为响应值，试验因素及水平值见表4。

表4 桑白皮提取工艺响应面试验因素及水平设计

2.4.2响应面试验设计 采用Design-Expert 8.0.6软件，选择Box-Behnken法设计试验，按试验方案提取桑白皮样品，计算3个成分的含量，结果见表5。

表5 桑白皮提取工艺响应面试验设计及结果

2.4.3响应曲面结果分析 利用Design-Expert 8.0.6软件对表5结果进行多元回归拟合，得到桑酮G、桑酮H、桑辛素提取含量的回归模型，见表6，模型回归系数的显著性检验结果见表7～9。

表6 桑酮G、桑酮H和桑辛素的回归方程

表8 桑酮H回归方程的方差分析结果

表9 桑辛素回归方程的方差分析结果

由表7～9方差分析可知，桑酮G、桑酮H、桑辛素提取的回归模型均P<0.01，失拟项P值(分别为0.200 5、0.163 1、0.925 1)均大于0.05，表明模型具有极显著性意义，可充分表示响应值(Y1、Y2、Y3)与3个变量A、B、C的关系；3个模型的多元r分别为0.986 0、0.962 7、0.955 2，表明模型在所研究整个回归区域内拟合度较好，可用于桑白皮中桑酮G、桑酮H、桑辛素回流提取的含量预测。从表7可以看出，3个因素中，A和B对桑酮G提取含量影响极显著，C影响显著，其影响顺序为B>A>C；交互项中AB交互作用影响极显著，二次项中A2、B2影响极显著。从表8可以看出，对桑酮H提取含量的影响，一次项A和B极显著，提取时间C不显著，影响的主次顺序为B>A>C；AB交互作用影响极显著，二次项A2、B2影响极显著。从表9看出，A和B对桑辛素提取含量的影响极显著，提取时间C不显著，影响的主次顺序为A>B>C；交互影响因素中AB交互作用极显著，二次项中A2对桑辛素提取含量影响极显著。

由分析结果绘制出响应面3D图(图3～5)，直观表现了3个因素交互作用对桑白皮中桑酮G、桑酮H、桑辛素的提取含量的影响。三维曲面图越陡峭，表示交互作用影响越明显，三维曲面越平滑，表示交互作用影响越小。分别比较图3～5中的3组三维响应图，可知乙醇浓度与提取温度交互作用对桑白皮中桑酮G、桑酮H、桑辛素的提取含量均最为明显，而乙醇浓度与提取时间、提取温度与提取时间2组的交互作用对3个成分的提取含量均影响较小。这与表7～9的方差分析结果一致。

2.4.4验证实验 采用软件优化功能，在Optimization→Numerical→Criteria下，点击Solutions分别选择单个优化项，软件自动根据各项模型方程计算得到各因素最大预测值，预测的桑酮G最佳提取条件：65.75%乙醇，液料比14∶1，71.93 ℃提取107.81 min，提取质量分数为7.13 mg·g-1；桑酮H的最佳提取条件为：64.75%乙醇，液料比14∶1，74.66 ℃提取93.93 min，提取质量分数为1.75 mg·g-1；桑辛素的最佳提取条件：69.14%乙醇，液料比14∶1，100 ℃提取120 min，提取质量分数为1.70 mg·g-1。在Solutions下同时选择3个优化项，软件可按照3个成分含量计算的综合加权评分拟合得到各因素最大值，最终得三者同时提取的最佳工艺：68.64%乙醇，液料比14∶1，74.26 ℃提取110.45 min，提取质量分数分别为桑酮G 7.12 mg·g-1，桑酮H 1.75 mg·g-1，桑辛素1.68 mg·g-1。因进行单个成分提取的含量结果与同时进行提取的含量预测结果相差不大，故选择同时提取3个成分。考虑到实施提取工艺的可操作性，将同时提取的最佳工艺参数修正为：68%乙醇，液料比14∶1，74 ℃提取110 min。对该工艺进行3次重复验证，实际测得平均值分别为桑酮G 7.09 mg·g-1、桑酮H 1.74 mg·g-1、桑辛素1.69 mg·g-1，与预测值对比，相对误差分别约为0.30%、0.41%、0.42%。说明本实验提供的回归模型对实际情况的拟合较为真实，证明采用响应面法对桑白皮中桑酮G、桑酮H、桑辛素的提取工艺进行优化，不仅科学实用，而且快速可靠。

图3 乙醇体积分数、提取温度、提取时间对桑巴皮中桑酮G提取含量的交互影响图

图4 乙醇体积分数、提取温度、提取时间对桑白皮中桑酮H提取含量的交互影响图

图5 乙醇体积分数、提取温度、提取时间对桑白皮中桑辛素提取含量的交互影响

3 讨论

试验前期对HPLC含量测定条件进行了选择，比较了甲醇-水、甲醇-0.01%甲酸、乙腈-水、乙腈-0.01%甲酸、乙腈-0.02%甲酸5种流动相，结果发现，采用乙腈-0.02%甲酸作为流动相梯度洗脱，3种成分的分离度高，峰形良好，基线平稳；采用全波长对3种成分进行扫描，发现桑酮G和桑酮H最大吸收波长均为263 nm，桑辛素最大吸收波长为269 nm，最终选择以265 nm作为检测波长。

本试验对提取部位进行了筛选，发现3种成分在桑树不同部位中含量次序均为叶<枝<桑根白皮<桑根粗皮(桑根粗皮为桑根皮加工时刮下的外层栓皮，桑根白皮为刮去栓皮后的内层白皮)。市售桑白皮一般都会带有部分外层粗皮，本试验采用市售桑白皮作为试验材料。

本试验考察了提取方法、提取溶剂、溶剂浓度、液料比、提取温度、提取时间、提取次数7个因素，综合考虑毒性、试剂回收、提取效率及响应面法的变量要求等，选择以乙醇浓度、提取温度、提取时间作为考察因素，利用Design-Expert软件设计三因素三水平试验，通过数据分析及模型拟合，结合实际操作，最终确定同时提取桑白皮中桑酮G、桑酮H、桑辛素的最佳工艺：乙醇体积分数68%，液料比14∶1，提取温度74 ℃，提取时间110 min，该工艺桑酮G得率为 7.09 mg·g-1，桑酮H得率为 1.74 mg·g-1，桑辛素得率为1.69 mg·g-1。此外，本研究建立了同时测定桑白皮中桑酮G、桑酮H和桑辛素的高效液相色谱法。本研究可为桑白皮的有效成分提取、质量控制及开发利用提供参考。