短时高温胁迫对中华地鳖蛋白质和氨基酸含量的影响

李 越，李 晶，沈诗琪，杨雪清*

(1. 沈阳农业大学植物保护学院，沈阳 110866；2. 西北农林科技大学植物保护学院，陕西杨凌 712100)

中华地鳖EupolyphagasinensisWalker俗称地鳖虫、土元、土鳖虫等，属鳖蠊科地鳖或冀地鳖Steleophagaphancyi，其8～10龄雌虫可入药(国家药典委员会，2000)，是我国一种重要的药用昆虫(陈梅生，2011)。由于其具有治疗心血管疾病等药理作用(付英杰等，2005；雷琼，2011)，近年来被越来越多的人关注。研究表明，土鳖虫发挥药用作用主要是因为其体内富含的蛋白质、氨基酸等活性物质(杨红莲和刘梅，2005)。中华地鳖体内蛋白质含量达60%以上(王凤霞和吉爱国，2009)，体内还几乎包含了构成蛋白质的所有氨基酸及人体必需的7种氨基酸(周彦钢和任玉翠，1998)。

工业化发展导致全球气候逐渐变暖。预计至本世纪末，全球平均气温将升高1.5～4.5℃(戈峰等，2010；Hondetal., 2016)。中国作为气候变暖最显著的国家之一，预计未来将持续变暖(Teametal., 2015)。温度是影响昆虫生长发育最重要的因素(Hoffmann & Klaus, 2012)，高温对昆虫的影响主要表现在影响昆虫的发育速度(Luoetal., 2005)、生殖(Maetal., 2004a)和存活率(Maetal., 2004b)。这种影响，可能会通过对生物大分子的结构和功能改变而发生(杜尧等，2007)。然而，关于高温对昆虫的影响的研究主要集中于农林业害虫，在药用昆虫上很少有报道。中华地鳖人工饲养的室内温度应维持在25～30℃(唐庆峰，2005)，但在夏季极端高温天气、饲养室控温装置故障或电力中断，以及饲养密度较大等情况下，环境温度迅速升高，中华地鳖将遭受高温胁迫。尽管已有一些文献对中华地鳖蛋白质、氨基酸等活性成分进行了测定和报道，但在全球变暖的背景下，高温胁迫对中华地鳖体内活性物质的含量的影响尚不清楚。因此，本研究以中华地鳖8龄雌若虫为研究对象，设置了适温区较高温度(29℃)、中等高温(33℃)和高温(37℃)三组处理组和对照(25℃)组，研究了短时高温胁迫下中华地鳖体内总氮量、蛋白质、氨基酸等物质含量的变化。研究结果为进一步明确高温对中华地鳖药用价值的影响，以及为中华地鳖人工养殖条件提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试中华地鳖卵鞘于2016年10月19日购自山东省临沂市中药材市场，在人工气候箱(MLR-352H-PC，松下)中以温度为25±1℃，相对湿度70%±1%，光照强度为2 Lx，光周期为16 L ∶8 D条件下令其孵化并饲养。孵化后的若虫用人工饲料(潘红平和邓寅业，2014)进行喂养。人工饲料是由麦麸(购于山东济宁那一村庄农家粮)、花生粉(购于江苏淮安休闲户外渔具店)和鱼骨粉(PESQUERA HAYDUK S.A)按照4 ∶5 ∶1的比例以及少量蒸馏水(135 mL)炒制而成的。制作之前用高温灭菌锅(ToMY KG-SX-500, Niigata, Japan)在120℃条件下灭菌20 min，制作完成后，装入灭菌完毕的长方形塑料盒中(13 cm×8.5 cm×5 cm)密封，放入4℃冰箱保存。饲料投喂时，切成方形，以利于中华地鳖取食。待若虫生长至8龄，挑选大小基本一致的雌若虫进行试验。

1.2 方法

将8龄雌若虫放置在饲养盒(32 cm×22 cm×15 cm)中，并分别于25℃(对照)，29℃、33℃、37℃恒温培养箱(HPX-9082 MBE，上海博迅)中进行2 h高温胁迫处理，试验设3次重复。

1.2.1短时高温胁迫对中华地鳖存活率的影响

从每个温度处理中随机挑取100头若虫，统计存活率，用毛笔轻拨试虫，不动则为死亡。

1.2.2短时高温胁迫对中华地鳖氮含量及蛋白质的影响

从每个处理的饲养盒中分别随机挑选出30头若虫，每10头为1个重复，用液氮速冻后放入坩埚中研磨，-80℃留存待测(样品中含水量为0%)。总氮量测定采用凯氏定氮法(陈智慧等，2008)。由于蛋白质中含氮量比较恒定，可由其氮含量计算蛋白质含量，故蛋白质含量的测定采用凯氏定氮法进行测量(罗美兰等，2013；赵武玲，2013)，计算公式为：蛋白质含量(%)=含氮量×6.25。

1.2.2短时高温胁迫对中华地鳖氨基酸含量的影响

采用檀华蓉的方法测定中华地鳖体内总氨基酸及游离氨基酸含量。

1.3 数据处理

试验所得数据结果采用SPSS Statistics 20软件进行单因素方差分析，处理间的多重比较采用LSD方法分析，结果采用GraphPad Prism 5软件作图。

2 结果与分析

2.1 短时高温胁迫对中华地鳖存活率的影响

中华地鳖8龄雌若虫经29℃、33℃、37℃高温胁迫处理2 h后，存活率均为100%，且与对照(25℃)相比无差异。与对照组相比，短时高温胁迫对中华地鳖雌若虫活力也无明显影响。

2.2 短时高温胁迫对中华地鳖体内氮含量及蛋白质的影响

结果表明，中华地鳖8龄雌若虫体内氮含量与对照(25℃)(13.52%±0.26%)相比，29℃(12.02%±0.87%)、33℃(12.74%±0.15%)、37℃(12.32%±0.11%)3个高温处理2 h后总氮量均明显减少(F3,7=5.122，P=0.035)；而3个高温处理组间总氮量无显著差异。

短时高温胁迫后中华地鳖8龄雌若虫体内蛋白质含量显著降低(F3,7=9.190，P=0.008)。3个高温处理组间蛋白质含量无显著差异(图1)。

图1 短时高温胁迫对中华地鳖体内蛋白质含量的影响Fig.1 Effects of short term high temperature stress on protein content of Eupolyphaga sinensis注：柱子上方的不同字母表示基于LSD方法的平均值±标准误间的差异显著(P≤0.05)。下图同。Note: Letters above the bars represent statistically significant differences (P≤0.05) of mean ± SE by LSD test.The same below.

2.2 短时高温胁迫对中华地鳖体内氨基酸含量的影响

2.2.1短时高温胁迫对中华地鳖体内总氨基酸含量的影响

经29℃高温处理2 h后，中华地鳖8龄雌若虫体内氨基酸含量升高，明显高于(F3,6=6.214，P=0.029)对照组和另外2个高温处理组；33℃和37℃高温处理与对照组8龄雌若虫体内氨基酸含量无明显差异(图2)。

图2 短时高温胁迫对中华地鳖体内总氨基酸含量的影响Fig.2 Effect of short term high temperature stress on amino acid content of Eupolyphaga sinensis

2.2.2短时高温胁迫对中华地鳖体内游离氨基酸含量的影响

通过实验测得中华地鳖体内各种游离氨基酸含量，并对其体内含有的人体必需的7种游离氨基酸进行比较。结果显示，29℃处理下中华地鳖体内苏氨酸(Thr)、甲硫氨酸(Met)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、赖氨酸(Lys)明显高于对照(29℃)和更高温度处理组(33℃、37℃)，缬氨酸(Val)各组差异不显著；在中华地鳖体内未检测到色氨酸(Trp)(表1)。

3 结论与讨论

高温对昆虫正常的生命活动有重要的影响(杜尧等，2007)，甚至会影响昆虫的存活率。二化螟Chilosuppressalis幼虫经36℃高温胁迫4 h，发育时间比在24℃下明显延长(罗举等, 2005)；而在33℃下处理8 h，麦长管蚜Metopolophiumdirhodum的死亡率达90%(Maetal., 2004b)。高温对昆虫的影响，主要表现为导致昆虫体内失水、改变细胞内离子浓度、破坏细胞骨架、使神经传导紊乱和造成蛋白质、DNA等生物大分子结构和功能改变(杜尧等，2007)。关于高温对昆虫的影响的研究主要集中于农林业害虫，在药用昆虫中鲜有报道。

本研究表明，短时高温胁迫(29℃、33℃、37℃)对中华地鳖8龄雌若虫存活率无明显影响，但对中华地鳖体内总氮量、蛋白质、氨基酸含量有显著影响。具体表现为，29℃、33℃和37℃短时高温处理后，中华地鳖体内总氮量和蛋白质含量与对照(25℃)相比均明显下降；29℃短时高温处理后中华地鳖氨基酸含量较对照和33℃、37℃高温处理组均显著升高。中华地鳖富含蛋白质和氨基酸，氨基酸组分直接参与蛋白质、酶的合成，是中华地鳖具有药用价值的主要活性成分(王凤霞和吉爱国，2009)。因此，高温对中华地鳖体内蛋白质和氨基酸有影响，直接影响中华地鳖的药用价值。周彦钢和任玉翠(1998)研究表明，人体必需的8种氨基酸占总氨基酸含量的34.5%，以甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、精氨酸和赖氨酸含量最高。另一研究报道，中华地鳖中含有的人体必需的8种氨基酸占总氨基酸含量的45.9%，含量最高的前8种氨基酸依次是丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、苏氨酸和丝氨酸(檀华蓉，1997)。本研究表明，中华地鳖8龄雌若虫中含量最高的8种氨基酸为谷氨酸、酪氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、精氨酸，这与前人结果(张勤，1998；周彦钢和任玉翠，1998)不是完全一致。本研究中，在中华地鳖种体内未检测到色氨酸，这与前人研究结果相符，可能是中华地鳖体内不含色氨酸，亦或是其含量较低超出了所采用的检测方法的检测限。此外，研究发现，29℃短时高温处理后多种游离氨基酸含量较其他高温处理组及对照组均有显著升高。类似的结果在甜菜夜蛾Spodopteraexigua中也有报道(Cohenaetal., 1982)。因此，在中华地鳖人工饲养过程中，适当进行短时临界高温处理可以提高其药用价值。然而，为何氨基酸含量在29℃短时处理后有明显升高，但在更高温度(33℃和37℃)胁迫后有无明显升高，有待在后续研究中探讨。

本研究对短时高温胁迫下8龄雌若虫总氮量、蛋白质和氨基酸含量进行了测定。高温胁迫是否对雄虫、其他生长发育阶段的雌虫的总氮量、蛋白质和氨基酸含量也有类似影响，有待进一步研究。

昆虫对高温胁迫的响应，可以表现为提高热适应性(或耐热性)，其主要的途径为诱导热激蛋白的产生(杜尧等，2007)。昆虫体内热激蛋白表达量与耐热性呈正相关，即热激蛋白表达量越高昆虫耐热性越强，这在多种昆虫中得到了证实(Leetal., 2011; Chenetal., 2014; Hondetal., 2016; Yangetal., 2016)。因此，短时高温胁迫是否对中华地鳖热激蛋白合成，以及对与热激蛋白合成通路上相关蛋白合成与代谢产生影响有待后续进一步研究。

本研究结果表明，短时高温(29℃、33℃、37℃)胁迫降低了中华地鳖总氮量和蛋白质含量，29℃短时胁迫提高了中华地鳖总氨基酸含量和苏氨酸(Thr)、甲硫氨酸(Met)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、赖氨酸(Lys)等6种人体必需游离氨基酸含量。研究结果将为进一步明确高温对中华地鳖的药用价值的影响，以及为中华地鳖人工养殖条件的提供理论依据，丰富和加深人们对气候变暖对昆虫影响的认识。