一种水杨醛双席夫碱荧光探针的合成及对Cr3+的识别

姚媛君,王娇,刘娅娜,韩辉,王丽*

(1.山西大学 化学化工学院,山西 太原 030006;2.山西大学 环境科学研究所,山西 太原 030006)

0 引言

人体内的铬元素主要以三价铬形式存在[1-3]。三价铬是葡萄糖耐量因子GTF(glucose tolerance factor)的组成成分,对葡萄糖的代谢至关重要[4]。在糖和脂代谢系统受到压力的动物中,Cr的药理学相关剂量可以提高胰岛素敏感性和血胆固醇水平,尤其是在Ⅱ型糖尿病的啮齿动物模型中[5]。Cr被认为是胰岛素作用中的人工第二信使[6]。血液中胰岛素水平的增加以及胰岛素信号通路的后续激活导致Cr从血流向组织移动,而Cr又通过与细胞中的胰岛素信号机制相互作用而增强胰岛素敏感性[5]。到目前为止,Cr3+的检测广泛采用原子吸收光谱法、电感耦合等离子体原子发射光谱法[7-8]、比色法、荧光光谱法[9-10]和电化学方法等。荧光光谱法具有简便、快速、灵敏等优点,从而受到科研工作者的关注,并显示出巨大的潜在应用价值。考虑到Cr3+对人体健康的潜在影响,所以设计合成一种高选择性的Cr3+荧光探针尤为重要。

目前,席夫碱探针由于合成简单和选择性好等特点,已经应用于识别金属离子,如Mg2+ [11],Hg2+ [12],Al3+ [13],Cu2+ [9]等。本文以2-肼吡啶和水杨醛为原料,合成了一种结构简单的4-甲基-2,6-二(吡啶-2-酰基肼甲基)苯酚荧光探针L(合成如图 1所示)。Jana等[14]合成了和本文类似的探针,在DMSO/HEPES buffer(V∶V=1∶9)体系中可以检测Zn2+。而本文合成的探针L在无水乙醇/水(V∶V=1∶1)体系中对Cr3+,Fe3+,Al3+有响应,通过加入掩蔽剂NH4F可以除去Fe3+,Al3+的干扰[15-16],从而实现对Cr3+的选择性识别,并可用于人体代谢物尿液中Cr3+的检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

PTI QuantaMasterTM400稳态/瞬态荧光光谱仪(美国PTI公司);Agilent Cary 8454紫外可见分光光度计(美国安捷伦科技有限公司);Bruker Avance Ⅲ HD 600 MHz超导核磁共振波谱仪(瑞士布鲁克科技有限公司);Thermo Scientific Q Exactive高分辨液质联用仪(美国赛默飞世尔科技公司);DHX低温恒温循环器(江苏天翎仪器有限公司);2XZ-4型旋片式真空泵(上海玉龙公司);Hei-VAP旋转蒸发仪(德国海道夫公司);KQ-100E型超声清洗器(江苏昆山市超声仪器有限公司);ZF-6型台式三用紫外分析仪(上海嘉鹏分析仪器有限公司)。

2-肼吡啶(质量百分数为97%,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);4-甲基苯酚(质量百分数为99%,阿达玛斯试剂有限公司),三氟乙酸(TFA,质量百分数为99%,阿达玛斯试剂有限公司);氘代二甲基亚砜(原子百分比99.8%,北京伊诺凯科技有限公司);无水硫酸镁(分析纯,太原新元素仪器仪表经销部),浓盐酸(质量分数为37%,太原新元素仪器仪表经销部);试剂无水乙醇,甲醇,二氯甲烷,石油醚,乙酸乙酯,均为分析纯,购买于天津市富宇精细化工有限公司;高效GF254薄层层析硅胶板(化学纯,青岛海洋化工有限公司);200-300目柱层层析硅胶(试剂纯,青岛裕民源硅胶试剂厂);试验用水为ELGA超纯水机PURELAB Ultra制备的二次水。

1.2 探针L的合成

对甲基苯酚(1.06 mL, 10.0 mmol),六亚甲基四胺(2.80 g,20.0 mmol)溶于10.0 mL三氟乙酸(TFA)中,然后在氮气下加热回流12 h。反应结束后,冷却至室温,加入盐酸溶液(210 mL,4.00 mol·L-1),冰浴条件下搅拌24 h,用二氯甲烷萃取,加入无水硫酸镁干燥,减压蒸馏除去溶剂,残余物用硅胶柱快速分离纯化(乙酸乙酯/石油醚,V∶V=1∶19),得到白色固体,即为2,6-二甲酰基-4-甲基苯酚a(0.328 g, 20.0%)。1H NMR (600 MHz, CDCl3), δ (ppm):11.45 (s, 1H), 10.22 (s, 2H), 7.77 (s, 2H), 2.39 (s, 3H)。13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ (ppm):192.27, 160.34, 137.34, 129.28, 123.28, 19.54.

2-肼吡啶(65.5 mg, 0.600 mmol),2,6-二甲酰基-4-甲基苯酚a(98.4 mg, 0.600 mmol)溶于5.00 mL甲醇中,回流3 h。冷却至室温,过滤掉固体,用甲醇重结晶得到淡黄色固体,即为4-甲基-2,6-二(吡啶-2-酰基肼甲基)苯酚探针L(60.0 mg,28.9%)。表征结果如下:1H NMR (600 MHz,

图1 L的合成路线Fig.1 Synthesis of probe L

DMSO-d6), δ (ppm):11.68 (d,J=22.0 Hz, 1H), 11.02 (s, 2H), 8.31 (s, 2H), 8.14 (t,J=13.7 Hz, 2H), 7.67 (t,J=8.3 Hz, 2H), 7.41 (s, 2H), 7.07 (d,J=8.4 Hz, 2H), 6.86-6.73 (m, 2H), 2.30 (s, 3H).13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ (ppm):156.21, 152.48, 148.01, 128.12, 127.75, 120.76, 115.18, 106.30, 20.13. HRMS(ESI):C19H18ON6for [L+H]+, calculated 347.1576, found 347.1617。

1.3 光谱性质的测定方法

将探针L溶于二甲基亚砜(DMSO)中,配制成浓度为2.00×10-3mol·L-1的储备液。将储备液稀释至合适的浓度,静置数秒后进行紫外可见吸收光谱和荧光光谱的检测。所有光谱实验使用10 mm石英比色皿,激发狭缝宽5 nm,发射狭缝宽5 nm,激发波长为380 nm。

2 结果与讨论

2.1 L和L-Cr3+的光谱特性

首先考察了L在无水乙醇/水(V∶V=1∶1)体系中与Cr3+的络合性能。L在321 nm、368 nm处有2个吸收峰,另外在395 nm处还有一个肩峰(图2a)。随着溶液中加入的Cr3+浓度逐渐增大,L的吸收峰发生红移,321 nm处的吸收峰红移至331 nm、368 nm处的吸收峰红移至377 nm。此外，原来288 nm处的吸收变为明显的吸收峰,同时在293 nm和344 nm处出现2个等吸收点,说明L和Cr3+形成了新的络合物。在365 nm的紫外灯下,溶液的颜色从无色变为红色(图2a插图A)。紫外可见吸收光谱中321 nm、368 nm处的吸收峰发生红移可能是由于Cr3+的吸电子作用,降低了L的反键轨道能量,导致π→π*跃迁红移。288 nm处出现吸收峰可能是源于配位原子的跃迁发生红移后,与源于未参与配位原子的跃迁分离而变得更加明显。如图 2a插图B所示,对L的吸收光谱进行高斯拟合,吸收光谱大致由4种跃迁组成,配位作用导致受配位作用影响的跃迁红移,而未受配位作用影响的跃迁基本不移动。

实验进一步研究了L和Cr3+配位后荧光光谱的变化。以380 nm为激发波长，L在578 nm处几乎没有发射峰(图 2b)。随着Cr3+浓度的逐渐增加，578 nm处的荧光强度显著增强，原因可能是L与Cr3+的络合后，探针分子刚性化[17]。基于这一现象建立了L与Cr3+配位后的荧光增强分析方法。

荧光滴定实验表明(图2b),在一定范围内随着Cr3+浓度的增加,L最大发射波长的荧光强度逐渐增强。体系在578 nm处的荧光强度I578 nm与Cr3+的浓度在4.00×10-6～4.00×10-5mol·L-1范围内呈线良好的线性关系(图2b插图)。由此可以实现探针L对Cr3+的定量检测,检测限为8.56×108mol·L-1(3 S/N)。通过与已经报道的检测Cr3+的光学探针相比,本文所报道的探针不仅具有更实用环保的检测体系,而且合成方法简单,检测限较低,为进一步拓展其在离子传感器方面的应用奠定了基础(表1)。

图2 L紫外吸收光谱随Cr3+浓度的变化(a) L荧光发射光谱随Cr3+浓度的变化(b)Fig.2 (a) Absorption spectra of L (1.0×10-5 mol·L-1) in the presence of differentconcentrations of Cr3+(0～10.0 equiv).Inset (A) The deconvolution of L’s absorption spectra.Inset (B) Fluorescence color change of L in the presence of Cr3+.(b)Fluorescence spectra of L (4.0×10-6 mol·L-1)in the presence of different concentrations of Cr3+ (0～10.0 equiv).The inset shows the fluorescence intensity of L as a function of Cr3+ concentration

表1 探针L与现有的Cr3+探针的比较

2.2 L对Cr3+的选择性检测

L对Cr3+的选择性实验中发现,Fe3+、Al3+对Cr3+的测定具有干扰作用,通过加入掩蔽剂NH4F可以除去Fe3+、Al3+干扰。除在Cr3+、Fe3+、Al3+的溶液中各加入5.00×10-5mol·L-1的NH4F掩蔽剂外,其余实验条件均相同,测定了其他金属离子对L荧光强度的影响,只有Cr3+能使L溶液的荧光增强(图3a)。同时考察了L作为荧光传感器检测Cr3+的抗干扰性,发现共存离子Zn2+和Cu2+对Cr3+有干扰,此时先加入和Zn2+、Cu2+等量的探针L,待L和Zn2+,Cu2+充分反应后,L可以继续检测Cr3+。其他干扰离子对L-Cr3+的荧光强度基本没有影响(图3b)。上述结果表明,L可以选择性的识别检测Cr3+,且在Cr3+检测中有较好的抗干扰能力。

2.3 结合模式

通过等摩尔连续变化法测定了L与Cr3+的络合比,当L与Cr3+的浓度比为1∶2时,体系荧光强度达到最大值(图 4a),表明L与Cr3+的络合比为1∶2。

图3 加入掩蔽剂NH4F后,L对金属阳离子的选择性(a) 阳离子竞争性实验(b)Fig.3 (a) Fluorescence spectra changes of L (4.00×10-6mol·L-1)in the presence of various metal ions (400×10-5mol·L-1) and “masking” reagent NH4F.(b) Fluorescence intensities of L (4.00×10-6mol·L-1)at 578 nm (I578 nm) upon addition of Cr3+ in the presence of interfered metal ions and “masking” reagent

图4 等摩尔连续变化法测L-Cr3+结合比(a)和B-H方程测L-Cr3+结合常数(b)Fig.4 (a) Job’s plot for L and Cr3+ complexation， the total concentration of L and Cr3+ is 4.00×10-5mol·L-1；(b) Benesi-Hildebrand plot from fluorescence titration data of L with Cr3+

图5 L与Cr3+结合模式图及核磁滴定图Fig.5 Top The proposed binding mode of L/Cr3+system. Bottom 1H NMR spectra of L in the presence of different concentrations of CrCl3·6H2O in DMSO-d6:(a) L; (b) L+Cr3+ (0.2 equiv.); (c) L+Cr3+ (0.6 equiv.)

此外,采用Benesi-Hildebrand方程[21]计算得出L与Cr3+的结合常数为2.57×109(mol/L)2(图4b)。

为了进一步探究L与Cr3+的结合模式,以DMSO-d6为溶剂,通过核磁滴定实验进行考察。如图5所示,加入CrCl3后,11.70处的羟基质子H3消失,8.31处的质子H4,H4′向低场区移动,质子H6,H6′,H7,H7′,H8,H8′,H9,H9′峰信号变宽,并轻微向低场区移动。由核磁滴定实验可知,L与Cr3+可能是通过亚胺N,吡啶N和酚羟基结合的,质子H5,H5′消失的原因可能是,用D2O配制的CrCl3·6H2O的滴加,使得质子H5,H5′被D2O置换。

2.4 实际尿样分析

为了评估探针L检测Cr3+方法在实际样品检测中的准确性和可行性,本文采用标准加入法对人体代谢物尿液中的Cr3+进行检测。收集两个健康成年人的尿液,过滤,稀释100倍,加入5.00×10-5mol·L-1的NH4F掩蔽剂,将3种已知浓度的Cr3+(0.00 mol·L-1,1.00×10-5mol·L-1,2.00×10-5mol·L-1)加入预处理后的尿液中,然后用标准线性方程分析尿液中的Cr3+浓度,每个样品重复测量3次。如表2所示,该探针能够检测加标Cr3+的浓度,回收率在96.5%～105.5%范围内,RSD值在2.05%～4.65%之间,表明本文建立的方法可以有效应用于人体代谢物尿液。

3 结论

本文设计合成了一种在无水乙醇/水(V∶V=1∶1)体系中识别检测Cr3+的4-甲基-2,6-二(吡啶-2-酰基肼甲基)苯酚荧光探针L。L在无水乙醇/水(V∶V=1∶1)体系中对Cr3+、Fe3+、Al3+均有响应,通过加入掩蔽剂NH4F可以除去Fe3+、Al3+的干扰,从而实现对Cr3+的选择性识别,其检出限为8.56×108mol·L-1。定量分析结果显示L与Cr3+的结合计量比为1∶2,结合常数为2.57×109(mol·L-1)。尿样检测的回收率为96.5%～105.5%,表明L对人体代谢物尿液中Cr3+的检测具有潜在的应用价值。

表2 实际尿样中Cr3+含量的回收率测定