外源NO对镉胁迫下大豆幼苗生理特性的影响

杨玉花，白志元，张瑞军，卫保国

（山西农业大学农业基因资源研究中心（山西省农业科学院农作物品种资源研究所），山西太原030031）

镉是植物体内的非必需元素，有转移快、难降解、毒性大的特点。随着我国城市化和工业化的进行，工业废水、废渣携带大量镉离子渗透入土壤中。同时纯度不高的农药和化肥中都有镉离子的残留，无节制的施用均导致了农田土壤中镉含量急剧增加。据统计，我国受镉元素等重金属污染的农业用地将近2 000万hm2，约占全国农业用地总面积的20% 。耕地中镉元素的不断增加，已经成为影响我国农作物生产及食品安全的重要隐患。赵毅等[1]研究发现，镉胁迫下，大豆幼苗根和叶的生长受到了严重抑制；邱志勇[2]研究表明，镉胁迫会降低大豆幼苗的光合色素含量，对光合作用产生严重阻碍；刘强等[3]研究发现，镉离子可使烟草细胞内产生大量O2-和H2O2等活性氧，从而损伤植物细胞，产生镉胁迫反应。

一氧化氮（NO）是植物体内重要的信号分子，能够调控植物体内多个生长途径和不同途径中多个基因的表达。目前已经证实的通路包括NO合成酶途径、硝酸还原酶、亚硝酸还原酶途径，并且这些途径广泛参与到其他信号通路[4-5]。李莉等[6-7]研究表明，适宜浓度的外源NO可以有效提高幼苗根长和茎长，增加植物体内光合色素的含量，增强植物的光合作用。马晓丽等[8]研究表明，在镉胁迫下，NO可以通过提高抗氧化酶的活性来减弱镉离子胁迫对小麦产生的负作用。近年来，随着镉污染情况越来越严重，科研工作者进行了大量关于缓解植物镉胁迫的研究。然而，关于外源NO对镉胁迫下大豆生理影响的研究鲜见报道。

本研究开展了外源NO缓解大豆幼苗镉胁迫的效应试验，通过测定大豆幼苗期生理指标，研究可缓解大豆镉胁迫的最适硝普钠（SNP）浓度，以期为镉污染防治和土壤修复提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试大豆品种为晋豆48号，是山西省农业科学院农作物品种资源研究所杂交大豆课题组于2014年通过山西省农作物品种委员会审定的一个大豆杂交种。

镉离子供体为Cd（NO3）2，购自山西飞达生物科技有限公司。NO供体为Na2［Fe（CN）5NO］·2H2O（硝普钠，SNP），购自山西飞达生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 种子萌发 选取均匀无病害的晋豆48号大豆种子，用灭菌水在室温下浸泡6～8 h。然后用75% 乙醇冲洗30 s，15% 的NaClO冲洗20 min，灭菌水洗涤3次，放入真空干燥箱40℃烘干1 h。试验设CK（处理液为灭菌水）和6个处理组，6个处理组中均添加0.5 mmol/L的Cd（NO3）2，pH值控制在5.4，并分别添加浓度为0、50、100、150、200、300μmol/L SNP溶液，分别命名为NO-0、NO-50、NO-100、NO-150、NO-200、NO-300。将大豆种子置于9 cm培养皿中的滤纸上，滤纸用不同浓度的SNP溶液处理，每个处理3次重复，每个重复30粒种子。大豆种子于25℃培养箱中培养，避光催芽3 d，在光照/黑暗12 h/12 h、相对湿度70% 下进行培养，此后每天以灭菌水补充蒸发掉的液体。

1.2.2 大豆幼苗形态指标的测量 将1.2.1培养7 d后的晋豆48号大豆幼苗进行茎长、根长等形态指标的测定。

1.2.3 大豆幼苗生理指标的测定 将1.2.1培养10 d后的晋豆48号大豆幼苗进行各项生理指标的测定。

叶绿素a、b和类胡萝卜素含量的测定：避光条件下在丙酮∶乙醇为1∶1（V/V）的溶液中磨碎晋豆48号大豆幼苗叶片，然后分别在470、649、665 nm波长下测定吸光度值。

SOD、POD和CAT活性采用彭艳等[9]的方法测定；APX活性采用陈海霞等[10]的方法测定；根尖O2-和H2O2含量采用ZHOU等[11]的方法，取根尖1 cm测定。

1.3 数据处理

试验采用Excel整理数据和作图，采用SAS v8软件分析数据。

2 结果与分析

2.1 外源NO对镉胁迫下大豆幼苗形态指标的影响

由图1可知，6个添加了镉离子的处理NO-0、NO-50、NO-100、NO-150、NO-200、NO-300在7 d的根长和茎长均显著短于未添加镉离子的CK，根长较CK分别降低79.08% 、55.60% 、31.75% 、59.52% 、67.56% 和75.64% ；茎长较CK分别降低74.49% 、59.70% 、39.15% 、55.69% 、69.41% 和76.95% 。说明镉胁迫对大豆的根长和茎长有较强的抑制作用。在存在镉胁迫的6个处理中，添加了SNP的NO-50、NO-100、NO-150、NO-200处理的根长和茎长均大于未添加SNP的NO-0处理，根长较NO-0处理增幅分别为112.30% 、226.32% 、93.56% 和55.08% ；茎长较NO-0处理增幅分别为57.96% 、138.49% 、73.66% 和19.89% 。说明SNP可有效缓解镉离子胁迫对大豆根长和茎长的影响。其中，SNP浓度为100μmol/L的处理NO-100的根长和茎长最长，分别为7.6、7.39 cm。NO-300处理的大豆茎长小于NO-0处理，降幅为9.68% ，说明较高的SNP浓度反而会降低其缓解镉胁迫的作用。

2.2 外源NO对镉胁迫下大豆幼苗叶片光合色素含量的影响

从图2可以看出，在镉胁迫下的NO-0、NO-50、NO-100、NO-150、NO-200、NO-300处理在叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量上均显著少于未添加镉离子的CK，叶绿素a较CK分别降低47.02% 、31.42% 、17.76% 、38.04% 、43.50% 、48.59% ，叶绿素b较CK分别降低49.88% 、23.25% 、16.00% 、27.75% 、49.13% 、57.25% ，类胡萝卜素较CK分别降低56.45% 、30.49% 、18.02% 、41.79% 、53.36% 、61.22% 。说明镉胁迫对大豆叶片的光合色素含量有较强的抑制作用。在相同浓度的镉离子胁迫下，施加SNP的浓度为100μmol/L时，大豆幼苗叶片的叶绿素a、b和类胡萝卜素含量有显著提高；其中，与未添加SNP处理NO-0相比，叶绿素a含量增加54.97% ，叶绿素b含量升高47.33% ，类胡萝卜素含量升高86.73% 。NO-300处理的大豆幼苗叶片各色素含量均显著下降，说明这个浓度的SNP对大豆的光合作用产生了抑制作用。

2.3 外源NO对镉胁迫下大豆幼苗叶片抗氧化酶活性的影响

由图3可知，NO-0、NO-50、NO-100、NO-150、NO-200、NO-300处理的SOD活性均不同程度低于未处于镉胁迫的CK，较CK分别降低33.12% 、24.44% 、10.29% 、25.06% 、32.19% 和45.59% ，说明镉离子对大豆体内的SOD活性有较强的抑制作用。在镉胁迫下，不同浓度的SNP对大豆叶片中的SOD活性有显著影响，其中，NO-50、NO-100、NO-150处理较NO-0处理的SOD活性均有提高，增幅分别为12.97% 、34.13% 、12.04% 。NO-300处理的SOD活性较NO-0处理有较大的下降，降幅为18.64% ，说明较大浓度的SNP会造成SOD活性的降低。

由图4可知，NO-0、NO-50、NO-100、NO-150、NO-200、NO-300处理的CAT活性均不同程度低于未处于镉胁迫的CK，降幅分别为49.20% 、38.67% 、7.09% 、26.65% 、34.48% 、47.34% 。且在镉胁迫下，不同浓度SNP对大豆叶片中的CAT活性有显著影响。NO-50、NO-100、NO-150、NO-200、NO-300处理的CAT活性较NO-0处理均有不同程度增加，增幅分别为25.91% 、90.76% 、50.61% 、34.53% 和8.13% 。

由图5可知，NO-0、NO-50、NO-100、NO-150、NO-200、NO-300处理的POD活性均不同程度低于未处于镉胁迫的CK，降幅分别为30.80% 、11.03% 、4.48% 、16.09% 、27.93% 和39.54% 。且在镉胁迫下，不同浓度的SNP对大豆叶片中的POD活性有显著影响。NO-50、NO-100、NO-150、NO-200处理的POD活性较NO-0处理均有增加，增幅分别为28.36% 、37.81% 、21.06% 、3.98% 。

由图6可知，镉胁迫下，NO-0处理大豆叶片APX活性较CK有显著下降，降幅为41.61% ，说明镉胁迫对大豆叶片中APX活性有明显的抑制作用。处于镉胁迫下的NO-100处理的APX活性不仅高于NO-0处理，同时还显著高于未添加镉离子的CK，较CK增加28.36% 。说明适量的SNP不仅可以抵消镉胁迫对大豆叶片中APX活性的影响，还可以大幅提升APX活性。NO-50、NO-150、NO-200处理的APX活性，均显著高于未添加SNP的NO-0处理，同时较CK下降不明显，较CK分别下降8.49% 、2.07% 和22.98% 。

由图7可知，NO-0、NO-50、NO-100、NO-150、NO-200、NO-300处理的叶片O2-产生速率均不同程度高于未处于镉胁迫的CK，增幅分别为81.14% 、57.89% 、22.38% 、42.73% 、51.14% 和71.49% 。且在镉胁迫下，不同浓度的SNP对大豆根部中的O2-产生速率有显著影响。NO-50、NO-100、NO-150、NO-200和NO-300处理的O2-产生速率较NO-0处理均有不同程度降低，降幅分别为12.83% 、32.44% 、21.20% 、16.56% 和5.32% 。

由图8可知，NO-0、NO-50、NO-100、NO-150、NO-200、NO-300处理的叶片H2O2含量均不同程度高于未处于镉胁迫的CK，增幅分别为58.03% 、41.32% 、10.21% 、25.23% 、34.88% 和51.36% 。且在镉胁迫下，不同浓度的SNP对大豆根部中的H2O2含量有显著影响。NO-50、NO-100、NO-150、NO-200和NO-300处理的H2O2含量较NO-0处理均有不同程度的降低，降幅分别为10.57% 、30.26% 、20.75% 、14.64% 和4.22% 。

3 结论与讨论

镉是大豆体内的非必需元素，会对大豆的正常生长起到抑制作用，降低大豆的产量和品质[12]。镉离子可损害大豆的根系，降低主根的生长长度和侧根数量，甚至会造成根部的畸形坏死[13]。同时镉离子也会破坏大豆的光合系统，降低叶绿素、类胡萝卜素的含量，抑制光合作用[14]。NO是广泛存在于植物体内的重要信号分子[15]。陈秀兰等[16]研究表明，在镉胁迫下施用外源NO可以有效缓解镉离子对水稻根的影响。张茜等[17]在棉花上的研究表明，适量的外源NO可增加植物体内叶绿素的含量，增加叶绿素相关基因的表达量，从而增强植物的光合作用。

本研究结果表明，较高浓度的镉胁迫对大豆幼苗根长、茎长产生明显的抑制作用。而适当浓度的外源NO可以有效减弱镉胁迫对大豆幼苗根长、茎长产生的副作用。这与于肇端等[18]在黄瓜上、巴青松等[19]在小麦上、李燕歌[20]在甜茶上的研究结果相一致。本研究发现，较高浓度镉离子会严重损害大豆的光合系统，而添加100μmol/L SNP可以有效缓解镉胁迫，提高植物光合色素的含量，改善其大豆叶片的光合作用。一方面可能是因为信号分子NO提高了类囊体膜蛋白的稳定性，从而降低了镉胁迫对类囊体膜的破坏作用；另一方面可能是由于NO激活了大豆叶片中的叶绿素表达基因，从而提高了光合色素的含量[15]。大量研究表明[21-22]，镉胁迫会导致植物体内积累大量氧的自由基，造成植物细胞膜过氧化，从而引起一系列的生理紊乱。在较低浓度的镉胁迫环境下，植物通过提高自身POD、SOD、CAT等保护酶活性和APX等抗氧化物酶活性，来维持体内氧的自由基产生和消耗的动态平衡。但是高浓度的镉离子会占据或替换保护酶和抗氧化物酶的活性中心，从而降低酶活性，无法行使正常功能，进而影响种子萌发、幼苗生长和光合作用[23-25]。本研究表明，在镉胁迫下大豆幼苗叶片中的POD、SOD、CAT和APX活性显著下降，根尖的O2-产生速率和H2O2含量显著上升，而通过加入100μmol/L SNP可有效提高大豆幼苗叶片中的保护酶和抗氧化物酶活性，降低活性氧的含量。

本研究以在高浓度镉胁迫下的晋豆48号为材料，探究了不同浓度SNP对大豆幼苗各项生理指标的影响。结果表明，适宜浓度的外源NO可以促进大豆种子萌发，增加叶片中光合色素含量，提高POD、SOD、CAT和APX活性，降低根尖的O2-产生速率和H2O2含量，从而有效缓解镉胁迫对大豆造成的伤害。