宏基因二代测序技术对医院传染性疾病防控的价值

林佳冰， 高晓东*， 胡必杰,2*， 陈 翔

1. 复旦大学附属中山医院医院感染管理科，上海 200032 2. 复旦大学附属中山医院感染病科，上海 200032

医院感染是指住院病人在医院内获得的感染，包括在住院期间发生的感染和在医院内获得、出院后发生的感染，但不包括入院前已开始或入院时已处于潜伏期的感染。医院工作人员在医院内获得的感染也属医院感染[1]。而传染性疾病较其他易发生院内感染的疾病而言，危害性更大。住院患者免疫力低下，易受感染，同时大量患者需进行气管插管、导尿管或中心静脉置管等感染高风险操作，一旦发生传染性疾病的院内传播，将带来巨大不良影响。因此，对医院内传染性疾病患者进行早期诊断并采取针对性的防控措施，对防止传染性疾病的院内传播与暴发，具有重要意义。

近年来，随着宏基因二代测序(metagenomic next-generation sequencing, mNGS)技术在感染性疾病领域研究的不断深入，基于mNGS的分子遗传学检测在感染性疾病中的诊断价值已逐渐被认识，mNGS已在多个领域被广泛应用[1]，如多种疾病的早期诊治、遗传学和微生物检测等。但mNGS在医院感染防控中的作用报道较少，因此，认识mNGS在传染性疾病的早期识别与诊断中的重要作用，对医院感染防控早期干预意义重大。

1 资料与方法

1.1 研究对象 回顾性分析2018年1月1日至2019年12月31日复旦大学附属中山医院收治的5例传染性疾病患者病例资料，包括一般资料、mNGS结果、常规微生物培养结果和医院感染防控相关干预措施等。本研究通过复旦大学附属中山医院伦理委员会批准(No.B2017-193R)，所有患者均知情并签署知情同意书。

纳入标准：(1)患者住院期间行mNGS检测；(2)mNGS结果为传染性疾病，且其传播可能会导致严重后果；(3)mNGS的标本质量合格，标本检测过程中质控合格，结果可靠。排除标准：(1)患者住院期间未行mNGS；(2)mNGS结果为非传染性疾病，或为传染性疾病，但其传播不会引起严重公共卫生事件；(3)mNGS过程中出现质控不合格。

1.3 mNGS (1)样本处理与核酸提取：全血标本取3～4 mL，预先离心后取上清液；除血以外标本取0.5～3 mL。然后各类型标本中加入玻璃珠混合震荡，采用TIANamp Micro DNA Kit(DP315,TIANGEN BIOTECH)试剂盒进行样本DNA提取。(2)构建文库：采用Agilent 2100 Bio-analyzer和定量PCR进行DNA文库质控，文库经环化形成单链环形结构后，滚环复制形成DNB纳米球备用。(3)测序：将DNB纳米球加载到测序芯片，采用BGISEQ-500(华大基因，中国)进行测序，根据测序结果剔除低质量数据后，比对微生物大数据库(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/)，将测序结果按照病毒、细菌、真菌和寄生虫等进行分类排列。

1.4 概念标准 (1)医院感染：对患者出院后该病区患者、医务人员及其他密切接触者随访30 d，观察是否出现新发相似感染症状人员，判断是否发生院内传播。(2)标准预防：针对所有病人的预防性措施，认定病人的血液、体液、分泌物、排泄物、损伤的皮肤、黏膜和被这些物质污染的物品具有潜在感染而采取的标准水平消毒、隔离等预防措施。无论患者是否确诊或疑似感染，都要采取标准预防。

2 结 果

2.1 一般资料 结果(表1)显示：5例患者纳入本研究，均为男性，平均年龄为45.4岁。3例患者以发热为主诉，1例以右上肢皮肤肿胀伴破溃流脓5 d为主诉，1例以左颈部搏动性包块1月余为主诉。5例患者中，有虫咬史1例，有疟疾感染史2例。

表1 5例传染性疾病患者一般资料分析

2.2 mNGS和常规培养结果比较 结果(表2)显示：5例患者常规微生物培养均为阴性，mNGS结果：炭疽芽孢杆菌1例，霍乱弧菌1例，结核分枝杆菌复合群1例，三日疟原虫1例，恶性疟原虫1例。

2.2.1 患者A确诊过程 2019年5月28日，送引流液行常规微生物培养，同时采集血标本送检mNGS。5月30日mNGS结果为炭疽芽孢杆菌，5月30日回报微生物培养结果为阴性。追问病史：患者于2019年5月初有着短袖搬运死牛史，随后出现右前臂伤口，结合mNGS结果及病史，初步确诊炭疽。后续患者被转至上海市公共卫生中心，期间通过PCR进一步确诊炭疽。

表2 5例患者mNGS和常规培养结果比较

2.2.2 患者B确诊过程 2019年8月21日采集伤口拭子标本送检mNGS，8月23日结果为霍乱弧菌。8月28日送检皮肤脓液及血行微生物培养，8月30日回报结果均为阴性。9月2号采集血标本送检mNGS，9月4日结果依然显示霍乱弧菌，检出大量唯一匹配的霍乱弧菌序列数，检出结果明确，且患者为慢性肝病患者，考虑非O1/O139霍乱弧菌引起的皮肤软组织感染。

2.2.3 患者C确诊过程 2019年11月15日行痰涂片找抗酸杆菌和痰分枝杆菌培养，11月17日回报结果均为阴性。2019年12月18日采集痰标本送检mNGS，12月20日结果显示：结核分枝杆菌复合群。12月20日结核菌感染T细胞斑点试验(T-SPOT)结果示A/B：24/67。患者C入院时未考虑患传染性疾病，住院过程中出现咳嗽、咳痰现象，但痰培养未见分枝杆菌，后根据mNGS结果及T-SPOT结果，确诊结核。

2.2.4 患者D确诊过程 2018年10月17日采集血标本送检mNGS，10月19日结果显示：三日疟原虫。10月20日回报血涂片镜检找疟原虫及进行寄生虫全套抗体检测结果，均为阴性。患者D有疟疾感染史，检出结果明确，同时结合患者此次生病期间发热特点及流行病学史，确诊疟疾。

2.2.5 患者E确诊过程 2019年1月7日行血涂片镜检找疟原虫，结果阴性，同时采集血标本送检mNGS，1月9日结果显示：恶性疟原虫。1月11日经中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所检测后，结果为疟疾快速诊断试剂卡显示抗原阳性，涂片阴性。患者E有疟疾感染史，mNGS检出结果明确，结合其流行病学史，确诊疟疾。

2.3 医院感染防控措施的调整 结果(表3)显示：5例患者入院时医院感染防控措施均为标准预防。根据mNGS结果，提早确诊传染性疾病并调整医院感染防控措施，随访30 d内，未出现院内传播新发病例。

表3 医院感染防控措施的调整和病例随访情况

2.3.1 患者A的防控措施 及时将患者A转入负压单间病房进行隔离，相关医护人员严格进行手卫生与口罩防护，对于需要进行密切接触操作者，要求穿戴隔离衣及防护鞋，必要时佩戴护目镜或面罩。患者所使用医疗设备进行严格消毒，加强环境清洁，患者出院后使用过氧化氢消毒机进行房间的终末消毒。对患者日常所更换被服及出院后的各种床单元用品统一装入感染性织物袋中进行清洁消毒，规范处置该患者的医疗废物。同时联系我院防保科，进行病例上报，并请具有专业传染病防控诊治的上海市公共卫生中心专家会诊，会诊后转至该中心进一步治疗。经上述干预后，随访30 d内，未出现院内传播的新发病例。

2.3.2 患者B的防控措施 霍乱通常由产霍乱毒素的O1/O139霍乱弧菌引起，在我国属于甲类传染病，但患者B未出现霍乱典型临床表现——排“米泔样”便。本患者为乙肝患者，血mNGS及皮肤伤口拭子均提示霍乱弧菌，培养结果均阴性，考虑非O1/O139霍乱弧菌可能性大，其传播力较O1/O139霍乱弧菌弱，但仍需重视，因此对该患者加强接触预防措施，相关接触预防措施同患者A。同时联系我院防保科，进行病例上报。对患者进行针对霍乱弧菌引起的皮肤软组织感染治疗后，患者病情好转出院，且随访30 d内，未出现院内传播的新发病例。

2.3.3 患者C的防控措施 及时将该患者转移至单间隔离，医务人员加强个人防护，佩戴医用防护口罩，高危操作时佩戴N95口罩，严格执行手卫生，尽量避免家属探视，加强通风。同时请上海市公共卫生中心专家进行会诊，后续转至该中心进一步治疗。经上述干预后，随访30 d内，未出现院内传播的新发病例。

2.3.4 患者D的防控措施 针对患者D，要特别注意防蚊灭蚊，避免蚊虫带来传播，保持病区干净卫生，注意通风。同时给予患者D正规抗疟治疗，患者好转出院。经上述干预后，随访30 d内，未出现院内传播的新发病例。

2.3.5 患者E的防控措施 请上海市公共卫生中心感染科会诊进行进一步病例确认，调整后防控措施同患者D，同时给予患者E正规抗疟治疗，患者好转出院。随访30 d内，未出现院内传播的新发病例。

3 讨 论

传染性疾病是由各种病原体引起的，能在人与人、动物与动物或人与动物之间相互传播的一类疾病。2020年1月20日，国家卫生健康委员会将新型冠状病毒肺炎纳入《中华人民共和国传染病防治法》规定的乙类传染病。中国目前的法定传染病有甲、乙、丙3类，共40种。其中不乏传播能力强、致病力强的疾病，故传染病仍是一个十分重要的公共卫生问题[5]。如果不能对其进行早期识别，并给予针对性的防控措施，一旦发生院内传播，将对医院内患者造成巨大威胁，甚至形成影响严重的公共卫生事件。

在医院的日常诊疗工作中，难免需要接触许多处于潜伏期或传染期的传染性疾病患者，同时，医院人流量大、交叉感染风险高，存在免疫力低下患者等众多高危人群，传播环节多且不易控制到位。并且许多医院，特别是基层医院普遍不重视传染性疾病防控，一旦出现严重传染性疾病暴发，后果不堪设想[6]。

目前传染性疾病的诊断主要依赖常规微生物培养法[7]。国内绝大部分临床微生物实验室均采用基于生化反应的自动或半自动微生物鉴定系统进行菌种鉴定。MALDI-TOF MS技术可分离细菌和真菌[8]，但因仪器价格与技术等原因，目前尚未在基层医院广泛使用。但是，由于标本培养采集不规范、送检时机不合理[9]及某些苛养菌常规方法难以培养等原因，常规微生物培养常呈现阴性结果，并且对一些少见、罕见及菌种复合体的鉴定，结果也不十分可靠[10-11]。而对病毒、寄生虫的检测，常规医院更是难以开展[12]。因此，借助常规微生物培养结果鉴别诊断传染性疾病时，感染控制部门常无法对疾病进行早期、准确地诊断，也就无法及时采取合适的防控措施，严重影响了传染性疾病的防控工作。

mNGS检测范围覆盖细菌、真菌、病毒、寄生虫，可在病原体未知的情况下寻找病原体，比起传统微生物培养法，监测范围更广、灵敏度更高[13]。目前mNGS在医院感染方面的应用，大多只涉及医疗机构环境的污染检测、利用全基因测序对医院感染暴发进行追踪及耐药基因组研究等领域[14-16]，而对医院感染防控中很重要的早期干预的应用还较少。mNGS在其他研究中体现出检出率高、耗时短、精确性强等优势[17-18]，如能应用到感染性疾病的早期诊断中，提早对患者进行针对性的干预措施，做好防护工作，保护高危人群，降低医院传播的风险，将会大大提升传染性疾病的医院感染防控工作效果。

本研究结果显示，mNGS可有效发现未知传染性病原体，快速鉴定疾病病原体，在最短时间内准确获取病原体的全面信息，同时，还可帮助进行传染性疾病的早期诊断，调整患者的治疗方案，对有效控制传染性疾病疫情也起到了决定性作用。并且，通过将mNGS的诊断标准进一步标准化、统一化，克服了诊断标准不明确、成本高的缺点[19-20]，使得mNGS在传染性疾病早期诊断中应用更为明确。若将mNGS常规化，将来可为医院感染防控工作做出更大贡献。

综上所述，mNGS在传染性疾病的早期识别与诊断中具有重要作用，可对医院感染防控早期干预起到良好的指导效果。