lys1-d缺陷型标记介导毕赤酵母超高拷贝质粒整合

2020-09-11邓明勇李画敏魏子贡

湖北大学学报(自然科学版) 2020年5期

邓明勇，李画敏，魏子贡

(湖北大学生命科学学院，湖北武汉 430062)

0 引言

得益于简单的分子遗传操作、能在高密度条件下生长、能高水平地生产外源蛋白以及具有高等真核生物类似的翻译后修饰功能，甲醇营养型毕赤酵母已经成为生产重组蛋白最重要的表达平台之一[1-2].

为了进一步提高毕赤酵母中外源蛋白的产量，研究者们已经提出了很多策略，其中最普遍的一个策略就是通过引入多个拷贝的外源基因来提高mRNA的水平[3].很多蛋白表达的实例已经显示这一策略能显著增加毕赤酵母重组蛋白产量[4-5].但是，这需要通过构建含有多拷贝外源基因的表达菌株来实现.传统构建毕赤酵母多拷贝菌株的方法有两种：第一种方法是通过体外构建含有多个重复外源基因表达盒的载体，然后将其整合到毕赤酵母基因组中[6]；另一种方法则是通过直接增加抗生素的浓度筛选整合有多个外源质粒的克隆[7].这两种方法都具有很大的局限性：利用体外构建多拷贝的方法通常费时费力、需要多轮重复构建，并且随着拷贝数的增加载体的构建愈发困难，最终通常无法得到理想中的高拷贝菌株；而利用抗生素筛选的方法需要较高的成本，并且，即使将抗生素浓度提高很多倍，最终得到的重组菌株中质粒拷贝数仍然很低[8].近来，一种利用leu2-d作为缺陷型标记介导毕赤酵母多拷贝质粒整合的方法已经被提出.leu2-d包含29 bp的酿酒酵母LEU2(beta-isopropylmalate dehydrogenase；参与亮氨酸生物合成第三步)内源性启动子以及完整的leu2开放阅读框.研究证明，利用leu2-d作为缺陷型标记能显著增加酿酒酵母中2μ型质粒的拷贝数[9].Maritza O B等研究发现，leu2-d也可以作为缺陷型标记介导毕赤酵母多拷贝质粒整合[10].这是因为当完整的leu2内源性启动子截短至29 bp时，依靠单拷贝的leu2-d无法补足亮氨酸合成的缺陷，只有整合足够拷贝leu2-d的菌株才能在MD培养基上生长.利用这一系统能直接筛选到含有5～20个质粒拷贝的毕赤酵母整合菌株，大大减少了构建多拷贝菌株的实验操作和成本.

本研究证明了使用一个仅携带15 bp的酿酒酵母LYS1(saccharopine dehydrogenase；参与赖氨酸生物合成最后一步)内源性启动子及其完整的编码基因(lys1-d)作为缺陷型标记能更加高效地介导毕赤酵母超高拷贝质粒整合，旨在为构建毕赤酵母多拷贝整合菌株增加新的工具.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒毕赤酵母X33、大肠杆菌XL10-gold、质粒pGAPZB、EGFP-N3均由实验室保存.

1.1.2 试剂蛋白胨、酵母粉、YNB购自美国BD公司；D-生物素、L-赖氨酸购自美国Sigma公司；博来霉素购自美国Invitrogen公司；质粒提取试剂盒、基因组提取试剂盒和DNA回收试剂盒均购自美国OMEGA公司；一步克隆试剂盒和荧光定量PCR试剂盒购自南京诺唯赞生物公司；限制性核酸内切酶购自北京Neb公司；高保真PCR酶购自北京全式金生物公司；其余试剂均为国产分析纯试剂.

1.1.3 gRNA表达盒根据毕赤酵母lys1(NCBI Gene ID:854852)的基因序列，利用CHOPCHOP网站设计gRNA，得到gRNA表达盒为：5’-CCAGTTCAAGTTACCTAAACAAATCAAACTTGGCCTGATGAGT CCGTGAGGACGAAACGAGTAAGCTCGTCGCCAAGGAATTGTTAGATACGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG TTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTGGCCGGCATGGTCCC AGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATGCTTCGGCATGGCGAATGGGACTCAAGAGGATGTCAGAAT GCC-3’(命名为：RZ-LYS1gRNA-RZ)，下划线处为N20序列.

1.1.4 引物本研究中所用引物序列如表1所示，引物均由上海生工生物合成.

1.2 方法

1.2.1 毕赤酵母lys1基因敲除质粒的构建及消除毕赤酵母CRISPR/Cas9表达质粒pPpT4_pHTX1-PARS1-hsCas9参考Weninger A的方法由本实验室前期构建并保存[11].对于lys1基因敲除，将质粒pPpT4_pHTX1-PARS1-hsCas9用NotI酶切后，与gRNA表达盒RZ-LYS1gRNA-RZ连接，得到的载体pPpT4_pHTX1-PARS1-hsCas9-LYS1gRNA即能介导毕赤酵母lys1基因敲除.该质粒上携带一个博来霉素抗性基因(ble)和毕赤酵母自主复制序列(PARS1)，它们能分别用于转化子的筛选和质粒复制.此外，由于PARS1序列极易丢失，只需要在无抗生素抗性的培养基上传代即可筛选出消除CRISPR/Cas9质粒的敲除突变株[12].

表1 本研究使用的引物

图1 pGK1-lys1-d-EGFP载体图谱

1.2.2 构建表达载体pGK1-lys1-d-EGFP首先，以毕赤酵母基因组DNA为模板，使用引物对GK1F/GK1R PCR扩增得到毕赤酵母gk1(3-phosphoglycerate kinase)基因的启动子(PGK1)片段，将PGK1片段与BglII和EcoRI双酶切的pGAPZB载体连接，得到pGK1载体[13].然后，以质粒EGFP-N3为模板，使用引物对EGFPF/EGFPR扩增得到EGFP基因片段，将EGFP基因片段与EcoRI和SalI双酶切的pGK1载体片段连接，得到pGK1-EGFP载体.最后，使用酿酒酵母基因组DNA作为模板，引物对lys1-dF/lys1-dR扩增得到的lys1-d片段；以pGK1-EGFP质粒为模板，引物对TEFF/AOXTTR扩增得到pGK1-EGFP片段；将两个扩增片段克隆连接即得到pGK1-lys1-d-EGFP表达载体(见图1).在电转化前，pGK1-lys1-d-EGFP载体使用XbaI酶切，得到的线性化载体能靶向整合到毕赤酵母染色体上的PGK1启动子位点.

1.2.3 毕赤酵母转化毕赤酵母电转感受态的制备参照Lin-Cereghino J的方法[14].电转化时，2 μg线性的载体或200 ng环形的质粒转化至50 μL感受态细胞中(1.5 kV，5.0 ms)，利用MD(0.34% YNB，1% 硫酸铵，2% 葡萄糖，0.4 μg/mL生物素和1.5% 琼脂)或添加适量抗生素的YPD培养基(1% 酵母粉，2% 蛋白胨，2% 葡萄糖)筛选重组子.

1.2.4 流式细胞仪检测细胞荧光强度接种适量毕赤酵母细胞于MD培养基中培养24 h(30 ℃，200 r/min)，将细胞转接至5 mL新鲜MD培养基中(控制细胞起始OD600为0.5)，24 h后收集细胞.取适量收集的细胞，用含有0.5%牛血清白蛋白的灭菌PBS洗涤细胞2次，然后用适当的灭菌PBS重悬细胞，控制细胞浓度为106个/mL.使用贝克曼CytoFLEX流式细胞仪检测细胞荧光强度，所有样品的数据均在相同的电压下收集.

1.2.5 荧光定量PCR确定质粒的拷贝数为了确定不同转化子整合的质粒拷贝数，使用荧光定量PCR的方法进行测定.首先，提取毕赤酵母X33基因组DNA，将其按1∶10的梯度稀释5次；然后，使用引物对qMET2F/qMET2R和qPGK1F/qPGK1R分别测定met2基因和PGK1启动子的Ct值(每个梯度设置3个重复)；最后，利用模板浓度的负对数与对应浓度下的Ct值绘制标准曲线并计算回归方程.依赖于同源单交换，pGK1-lys1-d-EGFP质粒能插入毕赤酵母基因组PGK1启动子位点[15].随着一个线性的质粒成功插入，基因组中PGK1启动子会增加一个拷贝，而met2基因一直是单拷贝的.因此，通过比较met2基因和PGK1启动子的拷贝数可以计算出转化子整合的质粒拷贝数.

2 结果

2.1lys1基因敲除将构建成功的pPpT4_pHTX1-PARS1-hsCas9-LYS1gRNA质粒转化至毕赤酵母X33菌株，在含有终浓度为100 ng/μL博来霉素的YPD平板上生长3 d，任意挑取一个单菌落提取其基因组并测序.测序结果如图2A所示，可以看出在基因组上gRNA靶向位置发生“TA”双碱基缺失突变(将此突变株命名为XL1).为了确认该菌株的表型，将其分别划线于MD和添加L-赖氨酸(终浓度0.04%)的MD培养基，结果显示(如图2B)，突变株无法在缺少L-赖氨酸的MD培养基上生长，证明lys1基因成功敲除.

图2 lys1基因敲除 A：lys1基因突变位点(红色框线处为gRNA靶向位置)； B：突变株XL1表型分析.L-Lys(0.04%)：培养基含0.04% L-赖氨酸

2.2 质粒整合按实验方法制备毕赤酵母XL1电转感受态细胞，将2 μg线性的pGK1-lys1-d-EGFP质粒电转化至50 μL感受态细胞中，于MD平板培养基中培养.8 d后，平板上长出8个单菌落，挑取这些单菌落于液体MD培养基中培养2 d，结果只生长出6个单菌落(将此6个菌株分别命名为：Clone1、Clone2、Clone3、Clone4，Clone5和Clone6).而另外2个单菌落无法生长，经推断，这可能是由于它们整合的拷贝数太低，以致无法在液体MD培养基中的正常生长.

2.3 绿色荧光蛋白表达为了确定这6个转化子表达绿色荧光蛋白能力的差异，利用流式细胞仪检测了同样条件下培养24 h的6个转化子的荧光强度.如图3所示，所有转化子的荧光强度远远高于未转化的毕赤酵母X33菌株.并且可以观察到6个转化子中绿色荧光蛋白的含量也存在很大的差异.经推断，这很有可能是由于这些转化子整合的质粒拷贝数不同造成的.

2.4 确定质粒拷贝数为了验证这一推测，利用荧光定量PCR的方法对转化子内的质粒的拷贝数进行了测定.首先，利用野生型X33基因组DNA绘制如图4所示met2基因和PGK1启动子对应的标准曲线(R2>0.99). 然后，提取这6个转化子的基因组DNA，分别测定met2基因和PGK1启动子的Ct值，并计算拷贝数.结果正如设想中的一样，这些转化子中质粒的拷贝数也存在非常大的差异.如表2所示，所有转化子中质粒拷贝数均处于19～168之间.

2.5 质粒拷贝数与EGFP荧光强度的相关性随即，又对这6个菌株表达外源蛋白的产量与整合的质粒拷贝数做了相关性分析.结果显示，这些菌株中质粒拷贝数与蛋白产量呈现显著的正相关性(如图5.R2> 0.99).从图中可以观察到整合了167.58个拷贝的Clone6，其荧光强度高达1 368 732，远远高于整合19.81个拷贝的Clone4的荧光强度100 318.这些结果表明，lys1-d缺陷型标记能有效地介导毕赤酵母超高拷贝质粒整合从而增加EGFP的表达.