云南不同产地白花蛇舌草挥发性成分研究

杨新周,吴 娜,陈云波

(1.德宏师范高等专科学校 民族医药研究所,云南 德宏 678400；2. 德宏师范高等专科学校 理工学院, 云南 德宏 678400；3.红河学院 理学院,云南 蒙自 661199)

白花蛇舌草(HedyotisdiffusaWilld.) 属茜草科(Rubiaceae)耳草属植物,是一种傣族药物,傣语称为“芽零哦”.白花蛇舌草全草入药,味苦、甘、性寒,具有清热解毒、活血化瘀、利湿通淋之功效[1-2].白花蛇舌草可用于治疗肝癌、肺癌、胃癌、肠癌等癌症[3-5],肝炎、咽喉痛、尿路感染等[6-8].白花蛇舌草因具有良好的药效,被广泛开发应用,在花红颗粒、抗骨髓炎片、男康片、肾炎康片的配方中均有白花蛇舌草的应用[9].

目前白花蛇舌草的研究主要集中于化学成分、药理药效的研究[10],而对云南不同产区白花蛇舌草挥发性成分的鉴别研究鲜见报道.挥发性成分作为一类化学组成复杂体系,对中药材质量控制具有一定意义,不同产地白花蛇舌草成分组成因地理环境不同存在一定差异,可作为质量评价的重要指标,因此,对不同产地白花蛇舌草挥发性成分进行研究并对其整体信息进行分析非常有必要.指纹图谱技术作为复杂化学体系质量控制的重要方法,可综合反映出植物特征信息[11-12].静态顶空-气相色谱法分析药品挥发性成分,该法操作简便、不需要对样品进行前处理,可对固体和液体进行直接分析[13].因此,采用静态顶空-气相色谱法,对不同产地白花蛇舌草进行测定,建立白花蛇舌草挥发性成分的分析方法及不同产地白花蛇舌草指纹图谱,并对其进行相似度分析、聚类分析和主成分分析,以期达到对不同产区白花蛇舌草的鉴别,为白花蛇舌草的资源和质量控制提供科学数据.

1 实验部分

1.1 材料与方法

1.1.1 主要试剂与仪器

气相色谱-质谱联用仪(GC-MS-QP 2010,日本岛津公司).

1.1.2 不同产地白花蛇舌草信息

不同产地白花蛇舌草信息见表1.

表1 白花蛇舌草产地信息

1.2 GC-MS条件

1.2.1 色谱条件

DB-1701色谱柱(30 m×0.250 mm×0.25 μm),进样口温度为250 ℃,柱流量为1.0 mL/min,升温程序：初始温度50 ℃,保持 10 min,以5 ℃/min速度升至120℃,保持1 min,再以8 ℃/min速度升至230 ℃,保持2 min,气相色谱仪总运行时间为48.75 min.

1.2.2 质谱条件

离子源温度220 ℃,接口温度250 ℃,检测器电压为0.88 kV,质量数范围在35～1000之间.

1.2.3 静态顶空(HS)条件

进样体积为2.0 μL,振荡箱温度为180 ℃、振荡速度为250 r/min、振荡时间为40 min,进样针温度150 ℃,进样速度500 μL/s,气体吹针时间120 s.

1.3 样品的制备及检测

称取不同产地蛇舌草干粉样品各0.2 g于顶空进样瓶中,密封,按照静态顶空(HS)条件和GC-MS条件进行检测.

1.4 数据处理

采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)》、Microsoft Office 2013、SPSS 19.0中文版进行数据处理.

2 结果与讨论

2.1 仪器检测条件的优化

以玉溪市新平县白花蛇舌草样品作为考察对象,通过单因素实验分别考察优化HS/GC/MS条件,考察因素分别是HS振荡温度150、180 ℃,振荡时间30、40 min,进样体积1、2 μL,GC进样口温度200、220、250 ℃, MS离子源温度200、220 ℃,接口温度200、220、250 ℃.实验结果表明,顶空进样的最佳条件为,HS振荡温度为180 ℃,时间为40 min,进样量为2 μL,GC进样口温度为250 ℃,程序升温过程为初始温度 50 ℃, 保持10 min,以5 ℃/min速度升至120 ℃,保持1 min,再以8 ℃/min速度升至230 ℃,保持2 min；MS离子源温度为220 ℃,接口温度为250 ℃.

2.2 顶空法测定白花蛇舌草挥发性成分

分别准确称取不同产地白花蛇舌草干粉各0.2 g,加入顶空进样瓶,按照1.2条件进行检测,得到白花蛇舌草不同产地GC-MS总离子流图.采用面积归一化法,分别对白花蛇舌草不同产地的挥发性GC-MS总离子流图进行积分,并结合质谱图库WILEY7.LIB、NIST05. NIST08进行检索,保留相似度大于90%以上的化合物,与积分后的定性峰表进行对照,并结合相关文献对检索结果进行分析,确定白花蛇舌草挥发性成分的化学名称、分子式,通过化合物的CAS号鉴定其结构,得出白花蛇舌草挥发性成分,表2为西双版纳州勐海县勐遮镇白花蛇舌草主要挥发性成分.

表2 白花蛇舌草主要挥发性成分

续表2

续表2

以表2为参照,对比其余21个不同产地白花蛇舌草挥发性成分,对比结果为：德宏江东乡样品检测出86个化合物,特征化合物是2-甲基丁酸；德宏州芒市三台山德昂族乡样品检测出97个化合物,特征化合物4个,分别是2,4-二甲基己烷、十六烯、油酸、2-己基癸醇；德宏瑞丽勐秀乡样品检测出90个化合物,特征化合物4个,分别是甲酸甲酯、2-丁酮、5-甲基-1-庚烯、2-羟基苯甲醛；德宏梁河样品检测出95个化合物,特征化合物6个,分别是甲基环戊二烯、2-甲基-3-丁烯-2-醇、己酸甲酯、2-环己烯酮、甘油、对甲基苯乙酮；德宏中山乡样品检测出80个化合物,特征化合物6个,分别是氯戊烷、糠醛、1,2,3-三甲基苯、3-甲基-2-环戊烯酮、γ-戊内酯、棕榈酸甲酯；德宏王子树乡样品检测出85个化合物,无明显特征化合物；德宏户撒乡样品检测出91个化合物,特征化合物是2-甲醇己酸；普洱文龙乡样品检测出98个化合物,特征化合物4个,分别是乙酰氧基乙酸、(E)-6-壬烯醛、DL-泛酰内酯、二十醇；普洱景谷乡样品检测出102个化合物,特征化合物2个,分别是甲酸异戊酯、2,3-二甲基-2-戊烯；普洱市景谷县景谷镇样品测出96个化合物,特征化合物3个,分别是3-戊醇、月桂烯、4-庚基苯酚；普洱振太乡检测出93个化合物,特征化合物2个,分别是2-甲基丁酸、仲辛酮；普洱市镇沅县者东镇检测出98个化合物,无明显特征化合物.

红河个旧检测出79个化合物,特征化合物6个,分别是2,3-二甲基吡嗪、2-环己烯-1-酮、2-吡咯烷酮、甘油单乙酸酯、5,6-环氧-3-羟基-β-紫罗兰酮、诱虫烯；红河绿春县样品检测出94个化合物,特征化合物5个,分别是环庚三烯、3,4-己二酮、马来酸酐、9-十八炔、十六酸乙烯酯；保山昌宁县样品检测出85个化合物,无明显特征化合物；保山腾冲检测出80个化合物,特征化合物1个,分别是二乙基酮；保山施甸县原何元乡测出95个化合物,特征化合物2个,分别是乙二醇甲醚、正二十烷；临沧耿马县样品检测出102个化合物,特征化合物5个,分别是甲酸异戊酯、环己基甲醇、3-氧代环戊烷羧酸、2,6,10-三甲基十二烷、(1R,2R,3S,4R)-2-甲酰基-4-甲基-α-亚甲基-3-(3-氧代丁基)环己烷乙酸；文山马关县样品检测出84个化合物,特征化合物是2,6-二甲基-4-庚酮；文山小街镇检测出95个化合物,特征化合物5个,分别是乙酰氧基乙酸、甲酸辛酯、乙基环戊烯醇酮、1-(2-甲基-1-环戊烯基)乙酮、2,3-二氢苯并呋喃；玉溪新平县检测出92个化合物,特征化合物4个,分别是2-羟基-3-甲基-2-环戊烯酮、1,2,4,4-四甲基环戊烯、2-甲酚、十二醛；玉溪元江县样品检测出76个化合物,特征化合物2个,分别是乙醇酸甲酯、2,3-二氢-3,5二羟基-6-甲基-4(H)-吡喃-4-酮.

2.3 不同产地白花蛇舌草挥发性成分HS/GC/MS指纹图谱

2.3.1 不同产地白花蛇舌草挥发性成分指纹图谱的建立

为建立共有模式的指纹图谱,将2.2中得到的不同产地白花蛇舌草挥发性成分GC-MS总离子流图数据以文本格式导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)》软件,设定1号白花蛇舌草为参照图谱,时间窗宽度为0.1,以平均数法自动匹配生成对照图谱(R),获得不同产地白花蛇舌草挥发性成分GC-MS指纹图谱,见图1.

2.3.2 不同产地白花蛇舌草挥发性成分指纹图谱的相似度分析

在2.3.1中,采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”对不同产地白花蛇舌草的挥发性成分GC-MS指纹图谱进行相似度分析,计算所有样品的相似度,将相似度计算结果导入Microsoft Office Excel 2013,得到白花蛇舌草不同产地挥发性成分相似度分布三维曲面图,见图2.

由相似度计算分析可得,不同产地白花蛇舌草之间色谱峰的相似度都比较小,说明不同产地白花蛇舌草间挥发性成分存在很大差异,不同产地间相似度最大的是西双版纳和普洱镇沅者东、西双版纳和临沧、文山马关和保山施甸、玉溪新平和保山施甸、临沧和普洱镇沅者东、玉溪新平和文山马关的白花蛇舌草,以上相似度均大于0.9,说明临沧、保山施甸、西双版纳、玉溪新平、文山马关地区白花蛇舌草挥发性成分与含量很相近.其余各地区的图谱与对照图谱之间的相似度在0.385～0.917之间,差值在0.532之间,说明不同地区之间白花蛇舌草挥发性成分和含量存在较大差异,分布不稳定.

由图2可知,分布图主要分为4层,相似度分布曲面图曲面曲折、峰多,说明白花蛇舌草挥发性分布不稳定,整体差异相对较大.

2.3.3 不同产地白花蛇舌草挥发性成分指纹图谱的聚类分析

将不同产地白花蛇舌草的峰面积数据导入SPSS19.0中,进行聚类分析,分析结果见图3.由图3可知,不同地区白花蛇舌草可以分为5类,德宏户撒乡为1类,德宏瑞丽为1类,德宏梁河为1类,玉溪新平和普洱文龙为1类,其他地区为1类,此聚类分析方法可对不同产地白花蛇舌草挥发性成分样品的GC-MS指纹图谱进行有效的化学模式识别.

2.3.4 不同产地白花蛇舌草挥发性成分指纹图谱的主成分分析

将不同产地白花蛇舌草的峰面积数据导入SPSS19.0中,选择分析-降维-因子分析,在描述中选择系数、显著性水平和行列式,在旋转中选择最大方差法,输出载荷图,使用正交旋转法进行主成分分析,获得不同产地白花蛇舌草主成分总方差解释表,见表3.由表3可知,不同产地白花蛇舌草样品共提取了5个主成分,主成分1(氨基甲酸铵、乙酸、2-已烯醛)、主成分2(2,3-丁二酮、糠醛、羟基丙酮、(E,E)-4-丙基-4′-戊基-1,1′-联环己烷、6,10,14-三甲基-2-十五烷酮、正己醛、正戊醛、乙酸甲酯、5-甲基呋喃醛、糠醇、2,3-戊二酮、氯甲烷、5-羟甲基糠醛、5 -甲基- 2(5H)-呋喃酮、异丁醛、植物醇、异戊醛、乙酸糠酯)、主成分3(硬脂烷醛、异戊醛、2-甲基丁醛、3-羟基-2-丁酮、蚁酸、叶绿醇、3-甲基呋喃、乙醛、2-甲基呋喃、异植物醇、2-十五烷酮、己酸、丙酸、邻苯二甲酸二异丁酯、十五醛、2-甲基四氢呋喃-3-酮)、主成分4(二十二醇、棕榈酸甲酯、3-羟基吡啶、异植物醇、正戊醇、二氢猕猴桃内酯)、主成分5(2-正戊基呋喃、甲酸异戊酯、乙二醇二乙酸酯 )的累计方差贡献率为81.62%,因为5个主成分的累计方差贡献率大于80%,所以能较好的代表白花蛇舌草不同产地23个样品全部信息,可以用主成分分析来反映样品的全部信息.

表3 不同产地白花蛇舌草主成分方差解释表

3 结语

本文以云南省不同产区白花蛇舌草为研究对象,利用顶空进样,气相色谱质谱法测定不同产区白花蛇舌草挥发性成分,探究出顶空进样气质联用测定白花蛇舌草的优化条件,在此优化条件下,测定22个不同产区样品中白花蛇舌草挥发性成分,22个不同产区白花蛇舌草挥发性成分整体上具有差异性.利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)》软件,建立不同产地白花蛇舌草挥发性成分GC-MS指纹图谱,并对不同产区挥发性成分进行相似度分析,得出不同产地白花蛇舌草之间色谱峰的相似度都比较小,说明白花蛇舌草不同产地间的挥发性成分存在很大差异,其中西双版纳和普洱镇沅者东、西双版纳和临沧、文山马关和保山施甸、玉溪新平和保山施甸、临沧和普洱镇沅者东、玉溪新平和文山马关相似度均大于0.9,说明临沧、保山施甸、西双版纳、玉溪新平、文山马关挥发性成分与含量很相近；各地区的图谱与对照图谱之间的相似度在0.385～0.917之间,说明不同地区之间白花蛇舌草挥发性成分和含量存在较大差异,分布不稳定.对不同产区白花蛇舌草进行聚类分析可得,云南白花蛇舌草不同地区可以分为5类,德宏户撒乡为1类,德宏瑞丽为1类,德宏梁河为1类,玉溪新平和普洱文龙为1类,其他地区为1类,此聚类分析方法可对白花蛇舌草不同产地挥发性成分样品的GC-MS指纹图谱进行有效的化学模式识别.对云南不同产区样品进行主成分分析,共提取了5个主成分,累计方差贡献率为81.62%,能较好的代表白花蛇舌草不同产地23个样品全部信息.