响应面法优化栀子中栀子苷的纯化工艺

陈婕 邓爱华 刘聃

摘要：采用正丁醇有机溶剂萃取法分离栀子中的栀子苷，考查萃取时间、萃取温度、栀子苷质量浓度、相比和pH值对栀子苷萃取率的影响。在单因素试验的基础上选取试验因素和水平，根据中心组合试验设计采用三因素三水平响应面分析方法，拟合试验因素与响应值的多元二次方程，对各个因素的显著性及交互作用进行分析，运用Design Expert 8.0.6优化试验条件。得到最佳工艺参数为萃取时间30 min，萃取温度45 ℃，栀子苷质量浓度3.0 mg/mL，相比为 0.5∶1，pH值7.0，栀子苷萃取率为30.27%。

关键词：栀子;栀子苷;正丁醇;萃取;响应面法

中图分类号：TQ461      文献标志码：A    doi：10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2020.01.046

Abstract：The extraction time，extraction temperature，geniposide concentration，volume ratio of n-butanol to solution and pH of the butanol extract of geniposide were analyzed. The effect of selected test factors and levels on the basis of single factors experiment，according to the central composite experimental design，3 factors and 3 levels of response surface analysis multivariate quadratic equantion，fitting the experimental factors and response value，was analysized and the interaction of various factors，the optimum process parameters obtained by organic solvent extraction process under the condition of Design Expert 8.0.6 optimization，the extraction time 30 min，extraction temperature 45 ℃，gardenoside concentration 3.0 mg/mL，volume ratio of n-butanol to solution 0.5∶1 and pH 7.0. Under this condition，the extraction rate of geniposide was 30.27%.

Key words：Gardenia jasminoides Ellis;geniposide;n-butanol;extract;response surface methodology

栀子（Gardenia jasminoides Ellis）中栀子苷含量可达10.4 mg/g[1]，其广泛用于改善睡眠[2]、清热泻火[3]、保肝利胆[4]等药物的开发。试验通过响应面法优化正丁醇萃取法纯化栀子苷的影响因素，并对各个因素的显著性及交互作用进行分析，以期为栀子中栀子苷的工业化分离提供理论依据和生产指导。

1   材料与方法

1.1   材料与仪器

栀子果，澧县扶农中药材农民专业合作社提供;栀子苷标准品，北京盛世康普化工技术研究院提供;甲醇（AR）、正丁醇（AR），湖南汇虹试剂有限公司提供。

PHS-25型pH计，上海精密科学仪器有限公司产品;TDL-40B型高速離心机，上海安宁科学仪器厂产品;RE52A型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂产品;UV-1800型紫外分光光度计，长沙市天恒仪器有限公司产品;101-2AB型电热鼓风干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司产品;HJ-6型磁力加热搅拌器，金坛市城东新瑞仪器厂产品;KQ5200DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司产品。

1.2   试验方法

称取栀子干果适量，粉碎过40目筛，石油醚脱脂，按料液比1∶20加入50%甲醇水溶液，在超声频率40 kHz，超声功率150 W下提取30 min，浸提3次，合并滤液过滤、真空浓缩得到栀子浸膏。取栀子浸膏溶于水配置不同浓度的栀子苷水溶液，再加入一定比例的正丁醇，萃取一定的时间后静置分相，紫外分光光度计检测栀子苷的萃取率。

1.3   试验设计

1.3.1   栀子苷标准曲线制备

精密称取15 mg栀子苷标准品，用甲醇定容至100 mL，配制0.15 mg/mL的标准品母液。分别吸取0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0 mL母液，加入甲醇定容至50 mL，得到1.5，3.0，6.0，12.0，18.0，24.0 μg/mL栀子苷标准溶液。以甲醇为空白对照，在波长238 nm处测吸光度。以栀子苷标准品质量浓度为横坐标（C）、吸光度为纵坐标（A），绘制标准曲线。得栀子苷的标准曲线方程为A=0.0173C+0.13，R2=0.999 9，R2接近于1，结果表明栀子苷质量浓度在1.5～    24.0 μg/mL线性关系良好。

1.3.2   单因素试验

配制一定质量浓度的栀子苷水溶液，加入正丁醇萃取。分别考查萃取时间（10，20，30，40，50 min）、萃取温度（15，25，35，45，55 ℃）、栀子苷质量浓度（2，4，6，8，10 mg/mL）、正丁醇/水溶液体积比（0.50∶1，0.75∶1，1.00∶1，1.25∶1，1.50∶1）、pH值（3.0，5.0，7.0，9.0，11.0）等对栀子苷萃取率的影响。

1.3.3   响应面试验设计

在单因素试验结果基础上，选取萃取温度、栀子苷质量浓度、正丁醇/水溶液体积比为考查因素，以栀子苷萃取率为响应值，运用Design Expert 8.0.6软件进行Box-behnken响应面试验设计和数据分析。

响应面试验因素与水平设计见表1。

2   结果与分析

2.1   单因素试验

2.1.1   萃取时间对萃取率的影响

萃取时间对萃取率的影响见图1。

由图1可知，萃取率随萃取时间的增加呈现先上升后下降的趋势。随着萃取时间的增加，栀子苷逐渐富集到有机相中，栀子苷的萃取率不断增大。由于正丁醇在上相易挥发，如萃取时间进一步延长，正丁醇体积减少，更多杂质进入正丁醇相，导致栀子苷萃取率下降，选择萃取时间为30 min。

2.1.2   萃取温度对萃取率的影响

萃取温度对萃取率的影响见图2。

由图2可知，萃取率随萃取温度增加呈现先增加后减少的趋势。萃取温度的增加会提高溶质的传质效率，提高萃取率，同时也会加快正丁醇的挥发速度，降低正丁醇量，选择萃取温度为45 ℃。

2.1.3   栀子苷质量浓度对萃取率的影响

栀子苷质量浓度对萃取率的影响见图3。

由图3可知，随着栀子苷质量浓度增大，栀子苷萃取率增加。当正丁醇相中溶解的栀子苷达到饱和状态时，继续增加栀子苷质量浓度，反而导致萃取率下降，选择栀子苷质量浓度为4 mg/mL。

2.1.4   相比对萃取率的影响

相比对萃取率的影响见图4。

由图4可知，随着正丁醇/栀子水溶液体积比的增加，萃取率先增加后降低。正丁醇质量浓度的增加，体系的极性发生改变，根据相似相溶原理，栀子苷萃取率在一定范围内增加，选择相比为0.5∶1。

2.1.5   pH值对萃取率的影响

pH值对萃取率的影响见图5。

由图5可知，随着pH值的增大，萃取率缓慢下降，但整体影响不明显。为了减少杂质离子的引入，选择pH值为7.0。

2.2   Box-behnken试验设计及结果

响应面试验设计及结果见表2，回归方程显著性检验结果见表3。

使用Design Expert 8.0.6对表2数据进行多元回归拟合，得到回归方程方差分析结果表3。对结果进行二次回归拟合后，得相比（A）、萃取温度（B）和栀子苷质量浓度（C）对栀子苷萃取率的二次多项回归方程：

Y=29.46-0.30A+0.25B-2.05C-0.64AB+2.66AC-

0.71BC-3.67A2-2.97B2-2.28C2.

方差分析显示模型显著（p<0.05），失拟项不显著（p>0.05），因此模型成立。从表3可知，一次项C、交互相AC及二次项A2，B2，C2对萃取率的影响非常显著（p<0.001）;交互相AB、BC对萃取率的影响极显著（p<0.01）;一次项A，B对萃取率的影响显著（p<0.05）;由F值可知，在所选试验范围内，A（相比）、B（萃取温度）和C（栀子苷质量浓度）对萃取率的影响顺序为C（栀子苷质量浓度）> A（相比）> B（萃取温度）。

2.3   响应面试验结果分析

交互作用对萃取率影响响应面图见图6。

对比曲面陡峭程度，发现与方差分析结果一致，梔子苷质量浓度与相比之间存在非常显著的交互作用，相比与萃取温度、萃取温度与栀子苷质量浓度之间存在显著的交互作用。

2.4   最优萃取工艺条件的确定

利用Design Expert 8.0.6软件由所建立的数学模型进行参数最优分析，得出最佳萃取工艺条件为萃取时间30 min，萃取温度45.93 ℃，栀子苷质量浓度2.68 mg/mL，相比0.398∶1，pH值7.0，预测栀子苷萃取率为30.18%。为了适合实际操作，调整条件萃取时间30 min，萃取温度45 ℃，栀子苷质量浓度3.0 mg/mL，相比0.5∶1，pH值7.0，通过3组平行试验，栀子苷萃取率平均值为30.27%±0.08%，与预测值无显著性差异（p>0.05）。证明此条件为栀子苷萃取的最优条件，该回归方程可用于实践。

3   结论

以脱脂及甲醇超声提取获得栀子提取物为原料，经正丁醇萃取富集栀子苷。通过响应面法获得最优萃取工艺参数为萃取时间30 min，萃取温度45 ℃，栀子苷质量浓度3.0 mg/mL，相比0.5∶1，pH值7.0，在此条件下，栀子苷萃取率为30.27%，与预测值30.18%无显著性差异（p>0.05）。通过正丁醇萃取富集栀子醇提取物中栀子苷，将为栀子的开发利用提供技术参考。

参考文献：

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杜正彩，齐彪，张明哲，等. 正交设计结合药效学实验优选桂栀助眠胶囊提取工艺研究[J]. 中草药，2019， 50（3）：81-88.

吴瑞军，钟国跃，曾金祥，等. 基于全二维液相色谱的牛黄上清丸指纹图谱研究[J]. 中草药，2019，50（3）：51-60.

姚文丽，杜鹏，刘学，等. 急性肝损伤对注射用清开灵（冻干）体内药动学影响的研究[J]. 时珍国医国药，2019（1）：65-69.◇