阿拉善双峰驼酸驼乳中乳酸菌的分离鉴定及耐酸和耐盐研究

FAHAD Shah，徐鸿洋，智超，宫海萌，张和平，赵国芬，*

（1.内蒙古农业大学生命科学学院，内蒙古呼和浩特010011；2.江南大学化学与材料工程学院，江苏无锡214122）

驼奶营养成分丰富[1-3]，有一定的保健功效，在糖尿病、肺结核、肝炎、贫血、食物过敏反应和消化道疾病等的治疗中有改善作用[4-6]。而酸驼乳风味浓郁，口感醇厚，极具民族特色，除了具有驼奶的营养价值外，还有一定的抗菌和益生特点，是一个极具市场竞争力的新产品。其中微生物菌系十分复杂，含有丰富的对人体有益生作用的乳酸菌及酵母菌资源。而不同地域的酸驼乳中的乳酸菌种类和数量又存在特别大的差异[7-10]，因此其风味也有所差异。但目前有关酸驼乳的研究甚少，酸驼乳的工业化生产急需开发其中的微生物资源。

阿拉善盟双峰驼是内蒙古自治区的特色动物，驼产业是阿拉善地区的支柱产业，驼奶资源丰富，本研究旨在充分利用好地区资源并结合产业优势，以开发传统发酵酸驼乳中的乳酸菌资源，生产自主研发的、风味独特酸驼奶制品为宗旨，从传统发酵酸驼乳中分离优势乳酸菌并进行鉴定、耐酸性和耐盐性研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试验原料

酸驼乳（ASR）、鲜驼乳（AXR）、马奶：来自内蒙古阿拉善地区牧民家中经过传统发酵、巴氏消毒。酸驼乳传统发酵数天放置于密封塑料壶中冷冻保存运到实验室，与鲜驼奶一起置于4℃冰箱中暂时保存。

1.1.2 试剂

TaqDNA聚合酶、2×PCRmix、溶菌酶（20000U/mg）、蛋白酶K（≥40 U/mg protein）：大连宝生物工程有限公司；引物（7F/1540R）、dNTP Mix：天根生化科技有限公司。

无水乙醇、异丙醇、氯化钠、D（+）-无水葡萄糖、柠檬酸铵、蛋白胨、琼脂、牛肉浸粉、酵母提取粉、硫酸锰、磷酸氢二钾、乙酸钠、硫酸镁、吐温-80：国药集团化学试剂有限公司。

1.1.3 主要设备

TG16-W微量高速离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司；THZ-100B恒温培养摇床：上海一恒科学仪器有限公司；E1509020紫外可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；DYY-10C型核酸电泳仪：北京市六一仪器厂；Ver Sa Doc2000凝胶成像系统：美国Bio-Rad公司；LD2X-30KA立式电热压力蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；徕卡DMLB型显微镜：德国徕卡显微镜与系统公司；DELTA320 pH计：METTLER TOLEDO。

1.2 方法

1.2.1 培养基的配制

按微生物学试验指导的方法配制[11]。

1.2.2 酸驼奶样品的梯度稀释、pH值测定与涂布培养

将从阿拉善牧人家获取的1份传统发酵的阿拉善双峰驼酸驼奶样品用pH计测定pH值，测定3次，取平均值。按照表1的感官评分标准进行评分然后将稀释到10-5的酸驼奶样品涂布在普通MRS固体培养基进行培养[12]。将长出的的单菌落刮取一定量，在MRS固体培养基上进行划线纯化4次，将分离纯化得到的疑似乳酸菌进行感官评定和革兰氏染色分析形态[13]。

表1 感官评定评分表Table 1 Sensory assessment scale

1.2.3 基于16 SrDNA疑似乳酸菌的分子生物学鉴定

利用细菌基因组提取试剂盒分别对分离纯化的疑似乳酸菌菌液提取基因组，利用7F/1540R引物聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增16 SrDNA片段[14]，然后将PCR产物电泳后回收，送由基因公司测序。将测序结果用Blast与NCBI中的Gene Bank数据库中近缘菌株的16 SrDNA进行同源性比对，使用MEGA7软件进行系统进化树的构建，确定疑似菌株的分类地位。

1.2.4 乳酸菌在MRS液体培养基中生长曲线的测定

将鉴定为乳酸菌的菌株分别接种到液体MRS培养基中37℃进行摇床培养，约4 h后按2%的体积比例接种到新的MRS液体培养基中进行培养，每隔2 h测定OD600nm。

1.2.5 乳酸菌耐酸性、产酸性和最佳pH值的确定

按2%的体积比例接种已鉴定的乳酸菌菌液到pH值分别调为4.0、3.0、2.0和1.0的MRS液体培养基中，37℃摇床培养，测定12 h的OD600nm，以在MRS培养基中培养为对照，分析各个菌株在不同pH值下的生长情况及存活率，来判断其耐酸性。

按2%的体积比例接种已鉴定的乳酸菌菌液到中性的MRS液体培养基中培养，分别测定12、24、48 h的pH值，判断各个菌株的产酸性能。

将已鉴定的乳酸菌接种在MRS液体培养基中进行活化，取活化好的菌株以3%体积比的接种量分别接种到 pH 值分别为 3.5、4.5、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的 8种MRS液体培养基中，37℃恒温摇床中生长24 h，测定OD600nm，确定其最佳pH值。

1.2.6 乳酸菌耐盐性分析

按3%的体积比例分别接种乳酸菌菌液到NaCl浓度分别为2%、4%、6%和8%的液体MRS培养基中，每隔2 h测定一次OD600nm，判断各菌对不同浓度的NaCl的耐受性。

1.2.7 乳酸菌对鲜马奶和鲜驼奶反发酵试验

将已经鉴定的乳酸菌菌液经扩大培养后以3%的体积比例分别接种到分装好的已灭菌的鲜马奶和鲜驼奶中35.5℃进行发酵，分别测定发酵24、48、72 h的pH值，考察其发酵情况。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的分离鉴定

将3株乳酸菌提取基因组DNA后，用16 SrDNA引物扩增16 SrDNA片段，1%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1，都有与16 SrDNA目的片段大小一致的条带出现，说明16 SrDNA基因片段扩增成功。

1号～3号乳酸杆菌的16 SrDNA基因片段构建的进化树见图2～图4。

图1 3株菌的16 SrDNA PCR产物电泳图Fig.1 Electrophoresis of 16 S rDNA PCR products of three strains of Lactobacillus

图2 1号乳酸杆菌的16 SrDNA基因片段构建的进化树Fig.2 Evolutionary tree by 16 SrDNA gene fragment of Lactobacillus No.1

图3 2号乳酸杆菌的16 SrDNA基因片段构建的进化树Fig.3 Evolutionary tree by 16 SrDNA gene fragment of Lactobacillus No.2

图4 3号乳酸杆菌的16 SrDNA基因片段构建的进化树Fig.4 Evolutionary tree by 16 SrDNA gene fragment of Lactobacillus No.3

传统发酵阿拉善双峰驼酸驼奶样品的pH值为4.12～4.16，经过感官评定，该酸驼奶样品的评分结果为：色泽26分，较均匀、乳黄色；口感14分，纯正；酸味15分，较酸；甜味8分，较淡；乳味13分，乳味很重。从中分离纯化出3株乳酸菌，菌落清晰、均一明显。颜色呈乳黄色，菌落相对较小、圆形、凸起，发出较浓酸味。菌体革兰氏染色为阳性，呈短杆状。

分别提取3株菌的DNA，用7 F/1540 R引物进行16 S rDNA扩增、电泳（图1）和回收后测序，将测序结果在Gene Bank中进行Blast，并使用MEGA7软件构建进化树，结果如图2～图4。结果表明，1号菌、2号菌和3号菌分别为Lactobacillus plantarum strain KC28、Lactobacillus plantarum strain K25和Lactobacillus sp.D1501，与这3个菌株的16 SrDNA序列相似性分别为99.9%、99.9%和99.8%，均属于植物乳酸杆菌属。

2.2 乳酸菌在MRS液体培养基中的生长曲线

将已鉴定的3株乳酸菌分别在液体MRS液体培养基中37℃培养，每2 h测定一次OD600nm绘制的生长曲线如图5。

图5 3株乳酸菌的生长曲线Fig.5 Curve of growth curve of three strain of Lactobacillus

3株菌均在4 h左右开始进入对数生长期，11.5 h后基本达到稳定生长期稳定期，一直持续到22 h左右，后逐渐进入凋亡期。

2.3 乳酸菌耐酸性、产酸性和最佳pH值

为比较3个菌株的耐酸性，分别将3株乳酸菌在pH值分别为4.0、3.0、2.0和1.0的MRS液体培养基培养，以MRS培养基为对照，比较在不同pH值环境中的生存率，来反映其耐酸性强弱，结果如图6所示。

图6 不同pH值下3株乳酸菌的存活率Fig.6 Survival rate of three strains of Lactobacillus at different pH

由图6可知，1号、2号株菌在pH值大于3时存活率都在50%以上，pH值为3时，3号菌存活率为48.2%，说明3株菌的耐酸性都很好，且在pH值为1时仍然能生长。pH值为2时，3株菌也可以生长，只不过生长速度下降了，说明3株菌均可以耐胃酸这样的环境。若这些菌种用来发酵驼奶，利于其顺利通过胃部进入肠道在消化道中生存而发挥其益生活性。

培养液中的pH值可反映微生物生长过程中的产酸性能。为了解3株菌的产酸性能，测定3株乳酸菌菌液分别在中性的MRS液体培养基中培养12、24、48 h的pH值，3株乳酸菌的产酸性能见图7。

由图7可知，3株菌均能产酸，培养基中pH值下降不大，且规律大致相同，产酸性能适中，不仅对成品酸驼乳的风味有重要影响，也可有效防止杂菌污染。

图7 3株乳酸菌的产酸性能Fig.7 Acid production performance of three strains of Lactobacillus

为了解乳酸菌培养的最适pH值将3株乳酸菌在不同pH值的MRS中培养24 h，测定OD600nm，结果见图8。

图8 不同pH值下3株乳酸菌的生长情况Fig.8 Growth of three strains of Lactobacillus at different pH value

结果表明3株菌的最适pH值均为6.5。耐酸微生物是指最适pH值接近中性时能生长，而嗜酸微生物是指最适pH值小于3的微生物，所以，3株菌均属于耐酸微生物，不属于嗜酸微生物。

2.4 乳酸菌的耐盐性

驼奶相对牛奶盐度较高，对盐度的耐受性反映乳酸菌可否在高盐浓度下发酵驼奶并正常生存。3株乳酸菌对不同NaCl浓度耐受性情况如图9所示。

图9 3株乳酸菌对不同NaCl浓度的耐受力Fig.9 Tolerance of three strains of Lactobacillus to different NaCl concentrations

由图9可知，含2%NaCl的MRS培养基中乳酸杆菌可以正常生长，其生长规律与在MRS培养基中基本相似；在含4%NaCl的MRS培养基中，乳酸杆菌的对数生长期被延迟，且未达到较高的菌体浓度，在达到相应较高生长浓度后受到抑制，剧烈下降后持续快速生长，说明4%盐浓度的耐受有一个适应的过程；在含6%NaCl的MRS中，乳酸菌的延滞期和对数生长期都得到延迟，而且生长速度明显变慢，出现了持续明显的抑制现象；含8%NaCl的培养基中，乳酸菌生长受到严重抑制，并且在生长到6 h时急剧下降后又有明显上升趋势，但始终受到高浓度的NaCl的抑制，基本无法在此环境中正常生长。耐盐微生物能够生长在很广的盐浓度范围内，但最适宜其生长的是在盐浓度0.2 mol/L（即 2.9%）[15]。所以，3 株均为耐盐微生物，这些耐盐乳酸菌在驼奶发酵过程中使用，有助于改善酸驼奶风味和防治杂菌感染。

2.5 乳酸菌可发酵鲜马奶和鲜驼奶

测定了3株乳酸菌在35.5℃发酵鲜马奶和鲜驼奶24、48、72 h的pH值，结果如表1和表2所示。

表2 乳酸菌发酵驼奶不同时间点的pH值Table 2 The pH value of lactic acid bacteria fermented camel milk at different time points

表3 乳酸菌发酵马奶不同时间点的pH值Table 3 The pH value of lactic acid bacteria fermented horse milk at different time points

经乳酸杆菌发酵而成的酸驼奶和酸马奶在酸度上与天然发酵驼奶和马奶非常接近，利用相同方法从中也可分离得到相应乳酸菌；经过感官评定也发现其口感与天然发酵酸驼奶和酸马奶极其相似（天然酸驼奶的pH值为4.12～4.16，天然酸马奶的pH值为3.80～4.20）。

3 结论

对来自阿拉善地区传统发酵的阿拉善双峰驼酸驼乳中的乳酸菌进行了分离鉴定及耐酸性和耐盐性的研究结果表明，分离出3株乳酸菌，经鉴定均为乳杆菌属，分别是 Lactobacillus plantarum strain KC28、Lactobacillus plantarum strain K25和Lactobacillus sp.D1501，是阿拉善地区传统发酵的阿拉善双峰驼酸驼乳中的优势菌。3株菌均为革兰氏阳性，菌落均清晰、较小、圆形、凸起，发出较浓酸味，颜色呈乳黄色；耐酸性很好；产酸性能一般；最适pH值均为6.5；在不超过2%的盐度下生长不受影响，为耐盐微生物。如果将分离菌株合理组合，会开发出生物学特性独特、风味优良的驼奶发酵菌剂，并且有望在胃肠道环境中发挥重要生理作用。