加压毛细管电色谱法分析调味果蔬汁饮品中5种有机酸

桑大席，张孔海

（信阳农林学院食品学院，河南信阳464000）

有机酸作为食品添加剂添加到食品中，具有增强酸味、调节pH值的作用，常用的有苹果酸、乙酸、柠檬酸等[1-2]。调味果蔬汁饮品是指在果蔬汁的基础上添加一些其他食品辅料，调配口味，其富含对人体有益的碳水化合物、维生素、矿物质的特点，深受消费者的喜爱。调味果蔬汁饮品中一般都会添加苹果酸、柠檬酸等有机酸作为酸度调节剂，具有调节饮品的pH值，改善饮品的风味，延长产品保质期的作用[3-4]。调味果蔬汁饮品中有机酸缺乏或过量均会导致口感不协调，因此需要对这类产品中有机酸的使用情况进行检测和监控[5-6]。

在调味果蔬汁饮品的研究中，检测其营养成分的研究较多，但与之相关的有机酸的检测研究较少。参考相关有机酸的检测方法，主要有离子色谱法[7-10]、气相色谱法[11-12]和高效液相色谱法[13-15]，3种方法各有优势，但分析时间都较长。加压毛细管电色谱技术是一种结合了毛细管电泳的高柱效以及高效液相色谱的高选择性的新型电动微分离技术，具备二者的双重分离机理[14-16]。与传统高效液相色谱相比，加压毛细管电色谱除压力流驱动外，还有电渗流驱动，柱效更高，分离速度更快，更适合复杂样品的多组分检测。本研究尝试将加压毛细管电色谱（pressurized capillary electrochromatography，pCEC）双重分离机理与二极管阵列检测器（photodiode detec array，PDA）的优点相结合，开发调味果蔬汁饮品中草酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、乙酸共5种有机酸的分析检测新方法，并对前处理方法进行优化，所开发的pCEC-PDA检测方法操作简单、分析速度快，具有实用价值。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

2100型加压毛细管电色谱系统、U3000型二极管阵列检测器：美国赛默飞公司。

草酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、乙酸标准品：国家标准物质中心。

1.2 色谱条件

色谱柱：Waters sunfire C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速：0.8 mL/min；进样量：20 μL。

柱温：30℃；流动相为乙腈∶水=80∶20（体积比）。

1.3 试验方法

参考相关文献[17-19]中有机酸的分离条件，采用亲水作用毛细管电色谱柱进行5种有机酸的分离。并通过对流动相添加剂体系、电压强度分离条件的优化，以及检测波长选择、前处理条件的优化，最终确定分析调味果蔬汁饮品中5种有机酸的整体方法。

1.3.1 流动相添加剂对有机酸色谱行为的影响

本试验以流动相（乙腈∶水=80∶20，体积比）为基础，在流动相中分别加入磷酸二氢钾（0.05 mol/L，pH 2.7）、偏磷酸（0.01 mol/L，pH 2.7）和磷酸二氢铵（0.05 mol/L，pH 2.7），并调节流动相体系不同的pH值，考察5种有机酸在不同流动相添加体系的分离情况和信噪比。

1.3.2 电压强度对有机酸色谱行为的影响

电压是加压毛细管电色谱试验条件中一个重要的试验参数，施加不同的电压强度对样品的分离能力和分离速度会产生不同影响，试验分别施加0、2、4、5、8 kV正向电压，考察5种有机酸在不同电压强度下的分离情况。

1.3.3 检测波长的选择

影响二极管阵列检测器灵敏度的关键参数一般是特征波长的选择，较佳的特征波长选择会降低杂质峰对目标的影响，减少干扰，一般建立适当的二极管阵列检测方法时，需对此参数进行优化。

1.3.4 标准曲线的制作

分别吸取一定质量的5种有机酸标准品，配制成浓度为 1.0、2.0、5.0、10.0、50.0 μg/mL 的混合标液，进仪器分析并绘制标准曲线。

1.3.5 样品前处理方法的优化

常用于液态样品提取溶剂的有甲醇、乙醚、磷酸、偏磷酸、乙醇等，鉴于甲醇、乙醚具有一定的毒性，而用磷酸、偏磷酸提取调味果蔬汁饮品时会因提取液中酸根阴离子的存在而影响有机酸的分离测定，因而综合考虑选择乙醇作为提取剂，并对提取剂的浓度进行优化选择。

不同提取方式对目标物的提取有很大影响，以10%乙醇作为提取剂，比较5种不同方式的提取效果。方式Ⅰ：样品提取剂加入调味果蔬汁饮品后直接离心（5 000 r/min，10 min）；方式Ⅱ：提取剂加入调味果蔬汁饮品后静置 30 min，离心（5 000 r/min，10 min）；方式Ⅲ：提取剂加入调味果蔬汁饮品后均质，离心（5 000 r/min，10 min）；方式Ⅳ：提取剂加入调味果蔬汁饮品后振荡30 min，离心（5 000 r/min，10 min）；方式Ⅴ：提取剂加入调味果蔬汁饮品后超声30 min，离心（5 000 r/min，10 min）。

1.3.6 加标回收试验及样品的检测

以已知含量有机酸的调味果蔬汁饮品为基质，加入混合标准液，选择优化后的前处理条件操作，上机检测，计算回收率，并以上述优化后的条件检测抽取的样品。

1.4 数据处理

试验所有数据以平均值表示，采用Excel 2013软件进行统计分析和绘图。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 流动相添加剂对有机酸色谱行为的影响

有机酸在色谱系统中的分离是依据在色谱柱和流动相之间的分配系数不同而进行的，由于其组分极性较大，流动相中的水比例不能太高，否则有机酸会发生解离。为了能使5种有机酸在色谱系统中以分子形式存在，一般使用酸性流动相来进行组分的分离。本试验比较流动相（乙腈∶水=80∶20，体积比）中添加磷酸二氢钾（0.05 mol/L，pH 2.7）、偏磷酸（0.01 mol/L，pH 2.7）和磷酸二氢铵（NH4）2HPO4（0.05 mol/L，pH 2.7）3种添加剂[20-21]，研究对5种有机酸色谱行为的影响，结果见图1。

图1 流动相组成对有机酸色谱行为的影响Fig.1 Effect of mobile phase composition on chromatographic behavior of organic acids

由图1可知，3种添加剂体系对5种有机酸的色谱行为影响不同。随着流动相组成的不同，5种有机酸的保留时间也不相同，且峰形、分离度和响应信号均发生了较大变化。对比3个图可知，当流动相添加剂为磷酸二氢钾（0.05 mol/L，pH 2.7）时，5种有机酸能达到很好的分离效果；而流动相添加剂为偏磷酸（0.01 mol/L，pH 2.7）或磷酸二氢铵（0.05 mol/L，pH 2.7）时，5种有机酸并不能达到相应的分离效果，且检测基线不稳定、噪音较大。因此，本研究选择流动相添加剂为磷酸二氢钾。

2.1.2 流动相添加剂pH值对有机酸色谱行为的影响

在流动相中加入0.05mol/L磷酸二氢钾，固定流速为0.8mL/min，柱温为30℃，4kV正向电压，用100 mmol/L磷酸调节流动相添加剂的pH值，比较2.1、2.3、2.5、2.7、2.9五个不同pH值的流动相添加剂对5种有机酸组分保留时间和分离度的影响，结果见图2。

由图2可知，从保留时间上看，随着流动相pH值的增大，草酸、柠檬酸、酒石酸的保留时间延长，而苹果酸、乙酸的保留时间基本不受流动相pH值的影响。从分离度上看，随着流动相pH值增加，草酸、柠檬酸和酒石酸分离度越好。综合考虑保留时间和分离度，选择pH 2.5的0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液作为流动相添加剂较佳。

图2 流动相添加剂pH值对有机酸保留时间的影响Fig.2 Effect of pH of mobile phase on the retention time of organic acids

2.2 电压强度的选择

在流动相中加入磷酸二氢钾溶液（0.05 mol/L，pH 2.5），分别施加 0、2、4、5、8 kV 正向电压，结果如图 3所示。

图3 电压强度对有机酸分离速度的影响Fig.3 Effect of voltage intensity on retention time for organic acids

由图3可知，随着电压升高，在电渗流的推动下5种有机酸的分离速度明显加快，同时色谱峰形变窄；当施加电压为+5 kV时，样品分离时间加快到15 min左右，苹果酸、乙酸的保留时间明显提前，并且5种有机酸样品完全分离。当施加电压达到+8 kV后，分离速度无明显加快，并且仪器电流急剧增大，故本试验最终选择+5 kV为施加电压。

2.3 检测波长的选择

本试验采用二极管阵列检测器检测，在检测波长190 nm～600 nm范围内对5种有机酸的标准溶液进行全波长扫描[22-23]，根据各个组分的全波长扫描选择最大的吸收波长，结果见图4。

图4 5种有机酸的全波长扫描图Fig.4 Full wavelength scanning chart of five organic acids

结果显示有4种有机酸在210 nm波长附近有较大吸收，只有草酸在257 nm和427 nm波长处有较大吸收，综合考虑，选用210 nm波长进行检测。

2.4 标准曲线的制作

5 种目标组分在 1.0 μg/mL～50.0 μg/mL 内均具有良好的线性关系，其中柠檬酸、酒石酸、苹果酸的检出限为0.20 mg/kg，定量限为0.60 mg/kg；草酸和乙酸的检出限为0.30 mg/kg，定量限为1.0 mg/kg，结果见表1。

表1 5种组分的保留时间、标准曲线、相关系数、检出限与定量限Table 1 Retention time，standard curve，correlation coefficient，detection limit and quantitative limit of five targets

2.5 样品前处理方法的优化

2.5.1 不同浓度乙醇溶液提取效果

图5为乙醇浓度分别为5%、10%、20%、30%、40%、50%做提取剂时各有机酸组分含量的测定结果。

图5 有机酸组分含量随提取剂配比变化情况Fig.5 The organic acids content increased with extracting ratio change agent

由图5可知，以柠檬酸为例，随着乙醇浓度的增加，提取液中柠檬酸检测含量呈现先增加后下降的趋势，在以10%乙醇作为提取溶液时，柠檬酸的含量能达到5.8 mg/100 g，而以20%乙醇溶液和30%乙醇溶液提取时柠檬酸含量分别降低了10.3%和15.5%，以40%乙醇溶液和50%乙醇溶液提取时柠檬酸含量分别降低了34.4%和60.3%。样品中其他4种组分含量变化也类似，也表现为用10%乙醇溶液提取时含量最高，其他浓度的乙醇溶液为提取剂时，组分含量分别有不同程度的降幅。

2.5.2 提取方式的选择

5种提取方式的试验结果如图6所示。

图6 不同提取方式对有机酸测定结果的影响Fig.6 Effect of different extraction methods on determination results of organic acid

由图6可知，以柠檬酸为例，提取方式Ⅴ显著高于其他4种提取方式；乙酸中方式Ⅴ和方式Ⅳ差异明显，但是明显高于方式Ⅲ、方式Ⅱ和方式Ⅰ；其他3种酸中也是提取方式Ⅴ的含量最高。由此可见，提取方式Ⅰ、提取方式Ⅱ和提取方式Ⅲ均有对目标物提取不完全的缺陷，而提取方式Ⅴ的效果优于提取方式Ⅳ的效果。因此，本方法选择提取方式Ⅴ即样品加入提取剂后超声 30 min，并离心（5 000 r/min，10 min）的提取方式为适宜。

2.6 加标回收率与精密度

以已知有机酸含量的调味果蔬汁饮品为基质，分别添加1.0、10.0、50.0 mg/kg 3个梯度浓度的有机酸标准混合溶液，进行加标回收试验，每个浓度重复测定5次，测定结果见表2。

表2 方法的回收率及相对标准偏差（relative standard deviations，RSD）（n=5）Table 2 Recoveries and relative standard deviations（RSD）of the method（n=5）

由表2可见，5种组分3个水平的加标回收率为90.5%～95.7%，相对标准偏差（RSD）为2.3%～4.6%，表明本试验所建立的方法能够满足检测实际样品需要。

2.7 实际样品测定

在市场上随机抽取5种调味果蔬汁饮品检测其中的有机酸，检测结果见表3。

表3 样品中5种有机酸的测定（n=5）Table 3 Determination of five organic acids in samples（n=5）mg/100 mL

由表3可以看出不同种类的调味果蔬汁饮品中含有的有机酸种类和含量差异较大，5款饮品中都含有苹果酸，而柠檬酸、酒石酸和乙酸这3种有机酸只有个别饮品中有，而草酸在这5种饮品中没有检出，整体有机酸检测到的种类与产品外包装标签中标出的一致。针对分析测定的结果，可以根据自身的需要，选用不同类型的调味果蔬汁饮品，来补充全面的或者单一的有机酸。

3 结论

本文利用加压毛细管电色谱-二极管阵列联用法，通过对流动相体系的组成、流动相添加剂的pH值、电压强度和检测波长的优化，以及样品提取液、提取方法的比较，建立了同时分离检测调味果蔬汁饮品中草酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸和乙酸5种有机酸的亲水作用电色谱法。结果表明，采用Waters sunfire C18色谱柱，选择pH2.5的0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液作为流动相（乙腈∶水=80∶20，体积比）的添加剂，电压强度为+5 kV，流速为0.8 mL/min，柱温为30℃，检测波长为210 nm的条件下，5种目标组分能在1.0 μg/mL～50.0 μg/mL内均具有良好的线性关系，检出限范围为0.20 mg/kg～0.30 mg/kg，定量限范围为0.60 mg/kg～1.0 mg/kg。样品加入10%乙醇提取并超声30 min后，加标回收率能达到90.5%～95.7%，RSD为2.3%～4.6%，所建立的方法具有可靠的准确度和精密度，能准确快速有效地检测调味果蔬汁饮品中的5种有机酸的含量，可为调味果蔬汁饮品中多种有机酸的分析和监控提供技术支持。