利用表面活性剂超声波辅助提取胡柚皮黄酮的研究

（肇庆学院食品与制药工程学院，广东肇庆526061）

常山胡柚是常山特有的一种柑桔地方品种，是自然界中的芸香科植物柚与甜橙的天然杂交品种，具有独特的风味[1]。目前，胡柚在加工产业中主要是将果肉制成果汁型饮料以及果脯，废弃大量的果皮果渣，而胡柚皮中含有丰富的果胶、多酚类化合物包括黄酮类物质以及挥发性精油等，适合将其进行开发利用，提高胡柚的整体价值[2-3]。由于合成抗氧化剂对人体存在着一定的潜在风险，故人们对黄酮等天然抗氧化剂越来越重视，需求量也逐年增大[4]。传统上，用水蒸气蒸馏法、索式提取法、回流提取法等方法提取时工序繁杂，耗时长，成分复杂并且损失大[5]。对胡柚皮用超声辅助提取或者表面活性剂协同微波辅助提取的研究报道较常见[6-9]，而将超声和表面活性剂结合起来提取胡柚皮黄酮的研究还鲜见报道。本试验采用表面活性剂与超声波协同辅助提取胡柚皮中的黄酮类物质，能够更大程度上使原料中的提取物溶解在溶液中，能有效地提高提取效率[10-13]。利用Design-Expert.V8.0.6软件中的Box-Behnken中心组合设计进行响应面优化试验[14-16]，并在优化试验的结果上进行验证得出最佳提取条件，本试验研究旨在为胡柚皮的进一步综合利用提供参考。

1 材料与仪器

胡柚：浙江省衢州市常山县；十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）：分析纯，山东西亚化学股份有限公司；十二烷基苯磺酸钠（sodium dodecyl benzene sulfonate，LAS）、吐温20（Tween-20）、聚乙二醇400（polyethylene glycol，PEG400）：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；95%乙醇、无水乙醇：分析纯，广州化学试剂厂；芦丁：98%，成都曼思特生物科技有限公司。

SK8200H超声波清洗器：上海科导超声仪器有限公司；UV-1100型紫外可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；AUY120电子分析天平：日本岛津公司；DHG-9070B数显电热恒温干燥箱：上海浦东荣丰科学仪器有限公司；TD3-800B台式低速离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。

2 试验方法

2.1 胡柚皮中总黄酮的提取工艺流程

胡柚→清洗→剥皮切块→烘箱干燥（60℃）→粉碎→过筛→称量→表面活性剂+乙醇溶液浸提→超声辅助提取→离心→抽滤→显色定容→吸光度测定→总黄酮提取率计算

2.2 操作要点

将胡柚皮切成小块，放进烘箱中设置60℃烘干至恒重，然后用粉碎机将其打成粉末状后过60目筛。参考文献[17-20]配制芦丁标准液、5%亚硝酸钠溶液、10%硝酸铝溶液、1 mol/L氢氧化钠溶液、60%乙醇溶液等溶液，并绘制芦丁标准曲线。

在100 mL的碘量瓶中放入称好的1 g胡柚皮粉，按照设定的料液比加入一半体积的表面活性剂溶液和乙醇溶液，放置在已提前40℃恒温的超声器中，超声一定时间后取出，用半微量抽滤装置进行抽滤。将滤渣和另外一半体积的表面活性剂溶液和乙醇溶液摇匀，继续超声相同时间，再抽滤，合并两次抽滤液，摇匀。将混合均匀的滤液倒入10 mL的离心管中，设置离心机以4 000 r/min离心15 min后，用吸量管准确移取上层离心液0.5 mL于25 mL比色管中，进行显色处理。以样品提取液空白进行调零，在最大吸收波长510 nm处依次测定吸光度，将吸光度代入标准曲线回归方程得出提取出来后总黄酮的质量浓度c（mg/mL），从而计算出总黄酮提取率。平行3次重复试验，取其均值。提取率计算公式：

式中：c为样品系列浓度梯度显色液中所含总黄酮的质量浓度，mg/mL；V为提取液体积，mL；n为溶液稀释倍数；m为称取的胡柚皮粉末质量，g；1 000为单位换算系数。

2.3 单因素试验

单因素研究时，设计表面活性剂质量分数为1%，超声时间为5 min，功率为500 W，乙醇体积分数为60%，料液比为1∶20（g/mL），在提取温度为40℃下进行辅助提取。当研究到相应因素时，改变其因素值进行研究，其他因素条件保持不变。在探究每一个单因素后，将其较佳的条件替换后再进行下一个因素探究。

2.3.1 表面活性剂类型的影响

准确称取1 g的胡柚皮粉4份，按照2.2试验方法，计算出总黄酮提取率。探究不同种类表面活性剂：吐温 20（Tween-20）、十二烷基硫酸钠（SDS）、十二烷基苯磺酸钠（LAS）、聚乙二醇 400（PEG400）对提取率的影响。

2.3.2 SDS质量分数对提取率的影响

准确称取1 g的胡柚皮粉6份，参照2.2的试验方法，计算出总黄酮提取率。探究加入质量分数为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的 SDS对提取率的影响。

2.3.3 超声时间对提取率的影响

准确称取1 g的胡柚皮粉6份，在SDS质量分数为2.5%的条件下，参照2.2中的试验方法，计算出总黄酮提取率。探究超声时间为 5、10、15、20、25、30 min对提取率的影响。

2.3.4 乙醇浓度对提取率的影响

准确称取1 g的胡柚皮粉5份，在SDS质量分数为2.5%，超声时间为25 min条件下，参照2.2中的试验方法，计算出总黄酮提取率。探究50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液对提取率的影响。

2.3.5 料液比对提取率的影响

准确称取1 g的胡柚皮粉5份，在SDS质量分数为2.5%，超声时间为25 min，70%乙醇溶液条件下，参照2.2中的试验方法，计算出总黄酮提取率。探究料液比为 1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60（g/mL）时对提取率的影响。

2.4 响应面优化

综合单因素试验操作与结果，选取SDS质量分数、超声时间、乙醇浓度、料液比等4个因素进行Box-Behnken响应面优化试验设计，利用Design-Expert.V8.0.6软件进行数据拟合得出优化工艺条件，设计如表1所示。

表1 因素水平设计表Table 1 Factor level design

3 结果与分析

3.1 芦丁标准曲线的绘制

芦丁标准曲线见图1。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Rutin standard curve

由图1可见，在0～0.05 mg/mL范围内，标准曲线方程式为 y=12.825x-0.007 1，即：A=12.825 c-0.007 1，决定系数R2为0.999 2，表明芦丁溶液与吸光度在选取的试验范围内具有良好的线性关系。

3.2 单因素试验对提取率的影响

3.2.1 表面活性剂类型对提取率的影响

不同种类表面活性剂对总黄酮提取率的影响见图2。

图2 不同种类表面活性剂对提取率的影响Fig.2 Effect of different kinds of surfactants on extraction rate

由图2可知，加入不同类型表面活性剂由于破坏细胞膜能力不一样使之浸出物也存在差异性，故在超声辅助提取中提取率也存在差异，PEG400的提取率最低，SDS的提取率最高，LAS次之，因此试验选择SDS作为提取胡柚皮总黄酮的表面活性剂。

3.2.2 SDS质量分数对提取率的影响

SDS质量分数对提取率的影响见图3。

图3 SDS质量分数对提取率的影响Fig.3 Effect of SDS quality score on extraction rate

由图3可知，在0.5%～3.0%范围内随着SDS质量分数的增加总黄酮提取率逐渐增加，当SDS用量达到2.5%时，提取率最大，大于2.5%时提取率降低。由于表面活性剂到达一定浓度程度后，对总黄酮的增溶作用不再增强，溶液中形成的胶束数量呈现饱和状态，因此试验选择SDS最佳用量为2.5%。

3.2.3 超声时间对提取率的影响

超声时间对提取率的影响见图4。

图4 超声时间对提取率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic time on extraction rate

由图4可知，胡柚皮中总黄酮提取率随超声时间而逐渐增加，当达到25 min时达到最大值，超过25 min后，提取率呈现下降趋势。超声波辅助提取会产生的空化效应使得原料中更多黄酮溶解到乙醇溶液中，但超声时间过长，部分黄酮结构会被破坏，同时有其他杂质溶出，使得黄酮提取率降低。因此试验选择超声辅助提取最佳时间为25 min。

3.2.4 乙醇浓度对提取率的影响

乙醇浓度对提取率的影响见图5。

图5 乙醇浓度对提取率的影响Fig.5 Effect of ethanol concentration on extraction rate

由图5可知，在乙醇体积分数为70%时提取率达到最大值，超过此浓度后，提取率呈现下降趋势。随着乙醇浓度的增加，植物细胞的通透性提高，有更多的黄酮溶于乙醇溶液中，但超过一定限度后，高浓度的乙醇对其他物质影响更大，从而溶解出更多的醇溶亲脂性杂质，影响总黄酮提取率。因此试验选择最佳乙醇体积分数为70%。

3.2.5 料液比对提取率的影响

料液比对提取率的影响见图6。

图6 料液比对提取率的影响Fig.6 Effect of raw material and solution ratio on extraction rate

由图6可知，随着提取溶液量的增加，总黄酮提取率先增加，当料液比为1∶30（g/mL）时提取率最大，随后，提取率逐渐减少。当溶液量增大时，样品粉末与溶剂的接触面浓度差变大，导致传质速率增加，黄酮类化合物更容易溶出；但浓度差到达一定程度后，其他非黄酮类化合物也会相继溶出，杂质增多，溶液黏度发生改变，影响了黄酮的溶出，从而提取率降低。因此试验选择最佳料液比为1∶30（g/mL）。

3.3 响应面方案设计及结果分析

响应面试验设计及结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Response surface test design and results

使用Design-Expert.V8.0.6软件对表2中响应面试验数据进行回归拟合，得到胡柚皮中总黄酮提取率（Y），SDS质量浓度（A），超声时间（B），乙醇浓度（C），料液比（D）的二次回归方程为：Y（%）=1.91-0.022A+0.032B+0.026C+0.063D-0.098AB-0.036AC-0.023AD+0.000 4BC-0.087BD+0.020CD+0.000 0166 7A2-0.037B2-0.062C2-0.057D2。回归模型的方差分析如表3所示。

从表 3 可知其自变量 A，B，C，D，AC，BD，B2，C2，D2的 P值均小于0.01，表明单因素A、B、C、D交互项AC、BD 与二次项 B2、C2、D2都对试验具有极显著影响，而其他项 AB、AD、BC、CD、A2则影响不显著。因此，二次多项回归方程可修正为：Y（%）=1.91-0.022A+0.032B+0.026C+0.063D-0.036AC-0.087BD-0.037B2-0.062C2-0.057D2，对胡柚皮中总黄酮提取率的大小影响顺序为：料液比（D）＞超声时间（B）＞乙醇浓度（C）＞SDS质量浓度（A）。模型的R2=0.952 0，校正决定系数 R2（adj）=0.903 9＞0.80 试验误差较小，表明模型拟合度较好，试验可操作。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

续表3 方差分析Continue table 3 Analysis of variance

3.4 各因素交互作用分析

经过分析各因素间的交互作用，剔除不显著项，显著项如图7所示。

图7 两因素交互作用的响应面和等高线图Fig.7 Response surface and contour map of two-factor interaction

乙醇浓度的曲线比SDS质量浓度的曲线走势更为陡峭，SDS质量浓度的曲线走势平缓。乙醇浓度对提取率的影响比SDS质量浓度更为显著。二者等高线图形状呈现椭圆形，表明二者具有显著的交互作用，且在SDS浓度为2.0%～2.25%，乙醇浓度为75%～80%的区域内提取率取得最大值。料液比的曲线比超声时间走势更为陡峭。料液比对提取率的影响比提取时间更为显著。二者等高线图形状呈现椭圆形，表明二者具有显著的交互作用，且在超声时间为20 min～25 min，料液比为 1 ∶35（g/mL）～1 ∶40（g/mL）的区域内提取率取得最大值。此结果分析与方差分析结果相一致。

3.5 验证优化条件

根据模型拟合得到胡柚皮中总黄酮的最佳提取工艺条件在SDS质量浓度为2.0%，超声时间为21.9 min，乙醇浓度为 76.54%，料液比为 1 ∶40（g/mL）时，总黄酮提取率可达到2.001%。从实际可操作角度考虑，将最佳提取工艺条件修正为SDS质量浓度为2.0%，超声时间为22 min，乙醇浓度为77%，料液比为1∶40（g/mL），在此条件下进行试验，最后得到胡柚皮中总黄酮提取率为1.973 1%。与模型拟合得到的预测值相对误差为1.4%，从而证明该响应面优化模型所得的数据准确，工艺条件可行性较高，具有实际生产应用价值。

4 结论

胡柚皮一直作为垃圾被废弃，其皮中的营养成分丰富，经加工利用可以大大提高胡柚皮的应用价值。本试验通过在乙醇溶液提取胡柚皮总黄酮的基础上，采用表面活性剂超声波辅助提取，在单因素试验的基础上进行响应面优化试验，结果表明此法提取能有效地提高胡柚皮总黄酮的提取率。经过优化验证，最佳提取工艺条件为：SDS质量分数为2.0%，超声时间为22 min，乙醇浓度为 77%，料液比为 1 ∶40（g/mL），提取温度为40℃。在此条件下，胡柚皮中总黄酮提取率可达1.973 1%。试验期望能为进一步研究胡柚皮黄酮的提取提供一定的理论基础，将胡柚皮变废为宝，提高胡柚的整体价值。