猕猴桃溃疡病田间快速检测技术优化

付 博，王家哲，任 平，张 锋，李英梅

(1.陕西省生物农业研究所 有害生物监测与防控研究中心，西安 710043；2.陕西省酶工程技术研究中心，西安 710600)

陕西省猕猴桃种植面积和产量分别占世界1/3和全国1/2以上，近年来，随着陕西省猕猴桃产业“东扩南移”战略的稳步实施，预计到“十三五”期间猕猴桃总种植面积可达10万hm2以上，产业规模继续保持全国首位[1]。但是随着种植面积的不断扩大，猕猴桃相关病害也日益增多，其中最严重的是猕猴桃细菌性溃疡病(Pseudomonassyringaepv.actinidae)。该病于1980年首次在日本发现，而后在世界各地相继出现，陕西自1991年在长安太乙宫首次发现猕猴桃溃疡病，受害面积逐年扩大，并逐渐演变成难以治愈的顽疾，被当地农民称为猕猴桃的“癌症”。一般果园发病率37.5%，病情指数18.85，严重果园植株死亡率达47%，甚至毁园，平均产量损失10%～15%，严重者达60%以上，给果农带来了巨大的经济损失[2-4]。

猕猴桃溃疡病的致病菌为喜低温高湿的弱寄生细菌，可在土壤、植物体和病残体内长期潜伏，当环境条件适宜时快速繁殖、发病[5]。国内外研究表明，猕猴桃溃疡病致病菌在侵染的初期阶段最易治愈，但由于潜伏期不表现病症，因此很难判断是否感染，从而错过了最佳的防治时期，一旦病情表现为菌脓流出，则任何防治措施都无效[6-7]。因此，猕猴桃溃疡病田间的无症带菌状态的早期诊断十分必要，是掌握病情发展阶段的重要依据，也是猕猴桃溃疡病防治的关键[8]。

本研究对猕猴桃溃疡病快速检测体系进行优化，并对田间猕猴桃溃疡病无症样本进行特异性PCR分子检测，建立田间快速检测的方法，为实现猕猴桃溃疡病早期诊断，控制病情发展提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 供试菌种

供试菌株为M13，由有害生物监测与防控研究中心实验室分离、保藏。

1.2 PCR特异引物

PsaF1(5′-TTTTGCTTTGCACACCCGAT- TT-3′)和PsaR2(5′-CACGCACCCTTCAATCAGGATG-3′)设计参考文献[9]的方法，扩增目的片段为细菌16S-23S rDNA ITS部分区域[8]。

1.3 PCR反应体系

反应体系25 μL，其中不含Mg2+的10×buffer 1.5 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，25 mmol/L MgCl21.5 μL，上/下游引物各10 μmol/L 1.25 μL，5 U/μLTaq酶2.062 μL，DNA模板2 μL，无菌去离子水16.938 μL。PCR扩增反应程序为：95 ℃ 2 min；94 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 5 min。PCR扩增产物经20 g/L琼脂糖凝胶检测，目的条带大小280 bp，根据实际扩增情况进行适当调整。

1.4 待测样品的制备条件优化

取新鲜猕猴桃溃疡病病健交界处组织(直径约3～5 mm，叶片病斑)0.1 g，切碎后等量装入4支1.5 mL离心管中，分别加入4种不同的样品浸泡液：磷酸缓冲液[9]、金氏B培养液[10]、PDA培养液[11]、LB培养液[12]，26 ℃分别浸泡8 h后各吸取1 μL浸泡液作为PCR反应模板。进一步设置浸泡时间为2 h、5 h、8 h、12 h和16 h，根据特异性条带的亮度选出最佳的浸泡时间。试验设3次重复。

1.5 化学增强剂对PCR检测效果的影响与优化

PCR反应体系中以制备的浸提液为模板，分别加入终质量浓度为50 μg/mL牛血清白蛋白(BSA)、体积分数为10%甘油及0.1 mg/mL白明胶作为反应增强剂。根据特异性条带亮度，筛选出最佳的化学增强剂，并进一步对其使用浓度进行优化。

1.6 无症带菌样品的优化处理

取新鲜健康猕猴桃叶片，剪成32片(约2 mm×10 mm)，8片为一组，共4组，分别放入1.5 mL离心管Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ中，取1 mL金氏B培养液和10 μL 4.0×108cfu/mL的猕猴桃溃疡病原菌液加入管中，作为模拟的无症带菌样品。处理Ⅰ：浸提液直接作为PCR反应体系模板；处理Ⅱ：浸提液10 000 r/min离心6 min，弃上清液，加入30 μL ddH2O，混匀后作为PCR反应体系模板；处理Ⅲ：加入终质量浓度为3 mg/mL的Na2SO3，26 ℃浸泡8 h后作为PCR扩增模板；处理Ⅳ：加入终质量浓度为3 mg/mL的Na2SO3，26 ℃浸泡8 h，10 000 r/min离心6 min，弃上清液，加入30 μL 3 mg/mL的Na2SO3混匀后作为PCR扩增模板，以新鲜显症猕猴桃叶片作为阳性对照。根据电泳条带亮度，筛选最佳的处理方式。设3次重复。

1.7 模板量对PCR扩增的影响

新鲜猕猴桃溃疡病病健交界处组织1 g，10 mL浸泡液制样后，分别取混匀的浸提液1 μL、 1.5 μL、2 μL、2.5 μL、3 μL、3.5 μL作为模板进行PCR扩增，根据电泳条带的亮度，确定最佳模板量。

1.8 田间猕猴桃溃疡病最佳检测时期的确定

采集陕西周至县猕猴桃植株萌芽期(2月上旬至3月上旬)、发芽期(3月中下旬至4月中旬)、孕蕾至开花期(4月中旬至5月中旬)、生理落果期(4月下旬至5月下旬)、果实成熟期(8月中下旬至9月下旬)和休眠期(11月下旬至1月下旬)当年生无症枝条和叶片(或芽苞)，按照本试验中优化的PCR检测方法，分析不同发育期猕猴桃溃疡病的检出率，确定田间PCR检测猕猴桃溃疡病的最佳时期。

2 结果与分析

2.1 样品浸泡液及浸泡时间的确定

浸泡液的浸提效果比对结果显示(图1)，金氏B浸泡液制备的模板在PCR扩增后呈现的DNA靶带清晰明亮，浸提效果最好，其次分别为样品PDA培养液、LB培养液、磷酸缓冲液，3次重复的结果一致。样品浸泡时间筛选的结果显示(图2)，浸泡2 h和5 h均未检出扩增产物，说明浸泡时间过短；但是浸泡时间超过12 h，也未检出目的片段，这可能是由于浸泡时间过长导致植物色素、多元酚等干扰物质的量增多，从而抑制了PCR扩增反应。当样品浸泡8 h、12 h时，PCR检测效果均较好，为了达到快速检测的目的，最终确定样品浸泡时间为8 h。

M.100 bp DNA Ladder;1.磷酸缓冲液；2.金氏B浸泡液；3.PDA培养液；4.LB培养液；5.阳性对照；6.清水空白对照；7.不含模板的阴性对照

M.100 bp DNA Ladder；1～5.样品浸泡时间依次为2 h、5 h、8 h、12 h、16 h；6.阳性对照；7.清水空白对照；8.不含模板的阴性对照

2.2 PCR反应中化学增强剂的作用效果

加入甘油或BSA后，比未加化学增强剂的PCR扩增条带明显变粗、变亮，增效显著；但白明胶对PCR扩增没有增效作用(图3)。从扩增的特异性电泳条带结果可见，当化学增强剂为φ=10%的甘油与50 μg/mL的BSA时，增效没有显著性差异，但由于BSA价格昂贵，因此确定选用甘油作为增强剂。进一步检测甘油体积分数对PCR反应效果的影响，结果显示φ=10%的甘油增效最明显(图4)。

2.3 无症带菌猕猴桃样品的处理优化结果

采用4种不同方式处理无症带菌猕猴桃样品，结果显示，加入浓度为3 mg/mL的Na2SO3并浓缩后的PCR检测效果最好(图5)。

2.4 模板量对PCR扩增的影响

按照文中“1.7”的方法制备溃疡病检测样品模板，通过加入不同模板量，比对PCR扩增检测效果，结果显示当模板量为1 μL、1.5 μL和2 μL时均可扩增出目标靶带，其中模板量为1 μL～ 2 μL效果最好；而模板量为2.5 μL、3 μL及3.5 μL时均未扩增出DNA靶带(图6)。

M.100 bp DNA Ladder；1.无化学增强剂对照；2.φ=10%甘油；3.50 μg/mL BSA；4.0.1 mg/mL白明胶；5.菌液阳性对照；6.清水空白对照；7.不含模板的阴性对照

M.100 bp DNA Ladder;1.不含甘油；2～5.甘油体积分数依次为5%，10%，15%，20%；6.阳性对照；7.清水空白对照；8.不含模板的阴性对照

2.5 PCR检测方法在猕猴桃不同发育期的应用效果

采用优化后的PCR方法检测猕猴桃不同发育期的无症带菌枝条和叶片(或花苞)，结果显示(图7)，猕猴桃树孕蕾至开花期的新生枝条，猕猴桃溃疡病的检出率最高，可达91.8%，同时期的无症带菌叶片检出率则为63.6%；猕猴桃其他发育时期不同检测部位的检出率均在63.6%以下。因此，在开展田间病害调查时，建议主要检测对象为孕蕾至开花期猕猴桃新生枝条，能够更加快速、准确、容易地检出致病菌，有利于提前预警并开展相关病害防治工作。

M.100 bp DNA Ladder;1～2.处理Ⅰ；3～4.处理Ⅱ；5～6.处理Ⅲ；7～8.处理Ⅳ；9.阳性对照； 10.清水空白对照；11.不含模板的阴性对照

M.100 bp DNA Ladder，1～6.每个反应体积(25 μL)的模板量依次为1.0 μL,1.5 μL,2.0 μL,2.5 μL,3 μL,3.5 μL；7.阳性对照；8.清水空白对照；9.不含模板的阴性对照

图7 PCR方法检测猕猴桃不同发育期无症带菌样本Fig.7 PCR method for detection of virgin bacteria at different developmental stages

3 讨论与结论

猕猴桃溃疡病是由丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonassyringaepv.actinidae)引起的细菌性、毁灭性病害，栽培种植过程中缺乏有效的检疫措施，通常在表现症状时才开始防治，很难有效控制病情，且由于病原菌清除不彻底造成菌体潜伏，从而逐年发病且越来越严重[13-15]。近年来，分子生物学技术在植物病害田间检测中的应用越来越多，其中PCR检测方法具有特异性好、实验成本相对较低、反应时间短等优点，更加适合在田间开展病害的快速诊断[16-17]。猕猴桃溃疡病为植株系统性病害，具有较强的隐蔽性，借助分子检测方法有助于及早发现病菌潜伏期的猕猴桃溃疡病株，并提前采取有效措施进行病害防控[7,18]。

本研究通过对田间采集的无症带菌猕猴桃样品的PCR检测条件进行优化，并采用特异性引物扩增细菌16S-23S rDNA ITS部分区域，可有效检出猕猴桃溃疡病的致病菌。张慧琴等[19]、伊春峰等[20]采用基于特异性引物扩增的PCR检测方法鉴定了已分离纯化的猕猴桃溃疡病致病菌，与本研究扩增的目的片段结果一致。但是与文献中报道的针对分离纯化菌株进行鉴定不同，本研究中的检测样品为田间采集的猕猴桃植株活体样本，通过检测条件优化，能够直接、快速、准确判断无病症表现的猕猴桃植株是否已被溃疡病致病菌侵染，因此，对指导PCR特异性分子检测在田间的应用更具有实际参考价值。

对田间采集的样本进行PCR模板制备时要排除多种因素的影响：(1)干扰物的抑制 在样本浸泡液中加入浓度为3 mg/mL Na2SO3能够降低植物色素和多元酚等PCR反应抑制物的干扰，特别是浓缩后的浸提液对PCR扩增效果明显提高，这与靶细菌浓缩导致的模板量增大有关，但是随着模板量逐渐增加，PCR反应体系中的植物色素、多元酚等抑制物也相应增多，对PCR扩增反应产生一定的抑制，因此要适当控制实测中的模板量。(2)植株生长期 影响无症带菌样本检出率的最显著因素是猕猴桃的生长期，研究结果显示，在猕猴桃孕蕾至开花期的新生枝条中溃疡病致病菌的检出率最高，是最佳的田间诊断时期，对提前有效检出带病植株并尽早针对猕猴桃溃疡病实施田间防控，特别是对新建园区，具有重要意义。