外源油菜素内酯对低温胁迫下水稻幼苗生长及生理特性的影响

周伟江，吴旺嫔，唐才宝，肖志芳，陈光辉，王 悦

(1.湖南农业大学 农学院,长沙 410128；2.水稻油菜抗病育种湖南省重点实验室,长沙 410128)

低温是影响作物生长发育及产量最主要的逆境之一[1]。水稻作为中国主要的粮食作物之一，在早春常遇到“倒春寒”天气，导致水稻秧苗遭受低温冷害，从而造成巨大的经济损失。

油菜素甾醇(Brassinosteroids，BRs)是一类广泛存在于植物体内的生理活性极强的植物激素[2]。大量研究表明，2,4-表油菜素内酯(2,4-Epibrassinolide，EBR)可以显著增强植物的抗逆性。李杰等[3]研究发现，喷施EBR能够缓解低温胁迫对辣椒幼苗生长的抑制作用，表现为地上部干物质的增加，植株抗低温能力增强。Hu等[4]研究表明，EBR预先处理黄瓜，能够提高植株光合速率和光化学效率，进而增强黄瓜幼苗低温耐受能力。李淑叶等[5]证明，喷施EBR能够减轻低温胁迫对棉花幼苗细胞膜的损害，通过提高叶绿素含量、提升PSⅡ反应中心活性和增强PSⅡ受体侧电子传递能力，进而提高低温胁迫下棉花幼苗的光合能力。丁丹阳等[6]发现，干旱胁迫下对烟草幼苗喷施EBR不仅能显著促进幼苗的生长和根系发育，通过提高叶绿素含量增强其光合速率，还能降低O2-产生速率，从而减少对幼苗的损伤，增强其耐旱能力。

目前关于油菜素内酯的研究大多集中于逆境胁迫下植物的光合作用效率[7]、生理特性[8]、种子萌发[9]等方面的影响，而对低温胁迫下油菜素内酯对水稻幼苗生长及生理特性的研究却鲜有报道。因此，本研究以‘湘早籼45号’为材料，通过不同浓度EBR喷施处理，测定低温胁迫下幼苗生长形态指标、丙二醛含量和抗氧化酶活性等，为水稻幼苗低温耐受机制研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试水稻(OryzasativaL)品种为‘湘早籼45号’，由湖南省水稻研究所提供；EBR购买于美国Sigma 公司。

1.2 试验方法

EBR先用乙醇溶解，再用蒸馏水定容，配成6个浓度，分别为0、0.001、0.01、0.1、1.0、10.0 μmol/L。挑选粒型整齐一致的水稻种子，经φ=40%次氯酸钠溶液消毒40 min后，再用灭菌蒸馏水浸种24 h，将浸种后的水稻种子清洗 3～5次，置于37 ℃进行催芽，催芽24 h后播种于留孔的PCR板中，置于盛有蒸馏水的定制培养盒进行培养。用蒸馏水进行缓苗，3 d后用1/2营养液进行培养，待幼苗生长至一叶一心期时，再用全营养液进行培养，营养液参照国际水稻研究所公布的水稻营养液配方，每3 d换一次营养液，培养环境温度(25±0.5) ℃，湿度(75±5)%。试验共设置7个处理：CK1，常温下喷施蒸馏水；CK2，低温下喷施蒸馏水；T1，低温下喷施0.001 μmol/L EBR；T2，低温下喷施0.01 μmol/L EBR ；T3，低温下喷施0.1 μmol/L EBR ；T4，低温下喷施1.0 μmol/L EBR ；T5，低温下喷施10.0 μmol/L EBR。待幼苗生长至两叶一心期时，于20:00用不同浓度EBR进行叶面喷施，为了增强叶片对EBR的吸收效果，在喷施溶液中加入φ=0.1%的吐温20，每个PCR板喷施5 mL处理液，连续喷施3 d后放入RLD-1000E-4人工气候箱(宁波乐电仪器制造有限公司)进行处理，每个处理6盆幼苗，每盆4个PCR板，每板48株幼苗，重复4次。常温对照温度为25 ℃/25 ℃(昼/夜)，低温处理温度为4 ℃/4 ℃(昼/夜)，白天光照度为 4 000 lx。光照时数12 h，相对湿度80%。于低温处理前(0 d)、低温处理后 3 d取样并测定相关指标。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 生长量 选取长势一致的幼苗20株，用电子游标卡尺测定距根基部1 cm处茎粗(水稻幼苗茎秆为椭圆形，测定长轴长度)，用直尺测量根基部到生长点的株高。蒸馏水将根系冲洗干净后用吸水纸吸干，用万分之一电子天平(Mettler Toledo ME 104E，瑞士)测定植株地上部分与地下部分鲜质量。将新鲜样品进行105 ℃杀青30 min后，60 ℃烘至恒量，用万分之一天平测定干质量。

壮苗指数=(茎粗/株高 + 根干质量/地上部干质量)×全株干质量。

1.3.2 根系形态分析 选取长势一致的植株20株，用HT2A-3独立版型扫描仪(上海中晶科技有限公司，中国)扫描幼苗根系图片并保存，用Microtek ScanWizard EZ型根系形态分析系统(上海中晶科技有限公司，中国)进行分析，得出根系长度、表面积、体积、平均直径、连接数、根尖数。

1.3.3 抗氧化系统相关指标 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性测定采用氮蓝四唑光化还原法[10]；过氧化物酶(peroxidase, POD)活性采用Kochba等[11]的方法测定；过氧化氢酶(catalase, CAT)活性采用Aebi[12]的方法测定；丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量采用Hodges等[13]的硫代巴比妥酸法测定；可溶性蛋白(soluble protein, SP)含量采用考马斯亮蓝G-250法[14]测定。

1.3.4 数据分析 使用Microsoft Excel 2007和SPSS 17.0软件进行数据分析和作图，用Duncan’s新复极差法进行差异显著性检测(α= 0.05)。

2 结果与分析

2.1 EBR对低温胁迫下水稻幼苗形态的影响

由表1可知，低温处理前(0 d)，T4处理相比对照(CK1、CK2)，其地上部分鲜质量、地上部分干质量、地下部分鲜质量、地下部分干质量以及壮苗指数均显著提高，分别增加13.55%、 23.68%、18.35%、20.99%和28.57%。低温处理3 d后，水稻幼苗生长会受到抑制，而T4处理的水稻幼苗株高、茎粗、地上部分鲜质量、地上部分干质量、地下部分鲜质量、地下部分干质量以及壮苗指数较CK2分别提高9.65%、9.22%、 17.04%、26.76%、26.32%、29.41%和40.74%，均达到显著性差异。

2.2 EBR对低温胁迫下水稻幼苗根系形态的 影响

由表2可知，低温处理前(0 d)，适宜浓度EBR能促进低温胁迫下水稻幼苗根系的生长，以T2和T4处理效果较好，而T5处理会抑制水稻幼苗根系的生长。低温处理3 d后，T4处理表现最好，其水稻幼苗根系的长度、表面积、体积、连接数和根尖数均显著提高，较CK2分别增加 34.29%、25.19%、14.42%、32.02%和42.8%。

2.3 EBR对低温胁迫下水稻幼苗抗氧化酶活性的影响

由图1可知，低温处理前(0 d)，水稻幼苗叶片与根系的抗氧化酶活性随EBR浓度的增大呈先增加后下降的趋势，并以T4处理效果较好，其幼苗叶片的SOD、POD和CAT活性相比CK2分别显著增加了47.71%、19.61%和21.44%；幼苗根系较CK2分别提高了38.37%、27%和50%，均达到显著性差异。低温处理3 d后，水稻幼苗根系SOD、POD、CAT活性增强，以T4处理表现最好，较CK2显著提高 47.15%、14.88%和73.92%。

表1 EBR处理及低温胁迫下水稻幼苗形态特征Table 1 Morphological characteristics of rice seedlings under EBR treatment and chilling stress

表2 EBR处理及低温胁迫下水稻幼苗根系形态特征Table 2 Root morphological characteristics of rice seedlings under EBR treatment and chilling stress

2.4 EBR对低温胁迫下水稻幼苗MDA及SP含量的影响

由图2可知，低温处理前(0 d)，喷施EBR能显著降低水稻幼苗叶片和根系的MDA含量，并增加其SP含量。其中，T4处理的水稻幼苗叶片中MDA含量相比CK2显著降低了25.09%，而SP含量则显著增加67.73%；根系中MDA含量较CK2显著降低20.21%，而SP含量则显著增加163.82%。低温处理3 d后，T4处理效果最为明显，其水稻幼苗叶片和根系的MDA含量相比CK2分别显著降低30.19%和34.03%，而SP含量则分别显著增加41.71%和56.48%。

图中不同小写字母表示同一时期同一指标处理间差异显著(P<0.05)。下同

图2 EBR处理及低温胁迫下水稻幼苗MDA及SP含量Fig.2 MDA and SP content of rice seedlings under EBR treatment and chilling stress

3 讨 论

低温胁迫主要通过减小幼苗叶片的栅栏组织厚度，造成植株生物量减少，从而影响植株形态建成、物质合成与积累[15]。有研究发现，10 ng/L的BR处理幼苗第二节间，便可以引起该节间显著伸长，促进细胞分裂，造成节间膨大，甚至开裂[16]。王道平等[17]研究表明，低温胁迫使水稻幼苗单株鲜质量显著减少，而EBR对单株鲜质量无明显影响。而本试验发现，在低温胁迫下水稻幼苗生长受到显著的抑制作用，但喷施1.0 μmol/L EBR具有明显的缓解作用，表现在幼苗的株高和茎粗均得到显著提升，幼苗地上部和地下部干鲜质量、壮苗指数和根冠比均较低温对照有显著的提高。这与徐晓昀等[7]、闫慧萍等[9]的研究结果一致，这可能与EBR能够通过诱导细胞分裂和伸长，改善渗透调节能力，从而增强植株抗逆能力有关。

根系是植物吸收水分与矿质养分的主要器官，其形态及构型在极大程度上决定着植株获取养分的能力[18]。康云艳等[19]研究发现，低氧胁迫下黄瓜幼苗根系生长遭受了明显的抑制作用，喷施EBR则能有效缓解这种抑制作用。赵雪松等[20]研究证明，1.0 μmol/L EBR处理6 h后，植株体内结合态生长素转化为游离态生长素的过程受到显著抑制，致使根尖顶端优势的丧失，从而促进侧根的生长发育。闫小红等[21]研究表明，在低温15 ℃下，无论是浸泡法还是添加法，不同浓度EBR对辣椒幼苗根长均表现为抑制作用。本试验研究表明，1.0 μmol/L EBR处理能极大地促进水稻幼苗根系生长，使根系长度、表面积、体积、平均直径、连接数及根尖数显著增加，而在低温胁迫下水稻幼苗根系生长受抑制，但喷施EBR能极大地缓解这种抑制作用。这可能与EBR能够在低温胁迫下，通过诱导转录因子BZR1，激活参与细胞壁形成的相关基因，促进根系细胞伸长有关。大量研究也表明，EBR能够通过与生长素互作，调控快速碱化因子，调节侧根发育，促进细胞的纵向生长[22-23]。

综上所述，低温胁迫下，适宜浓度的EBR能通过提高水稻幼苗株高、茎粗、地上与地下部分干鲜质量、壮苗指数及根冠比，增加根系长度、表面积、体积、平均直径、连接数以及根尖数，增强叶片与根系中抗氧化酶(SOD、POD、CAT) 活性，降低MDA含量，加快SP含量积累来缓解低温对水稻幼苗的伤害。因此，低温胁迫下喷施1.0 μmol/L EBR溶液能明显减轻低温胁迫对水稻幼苗生长的抑制作用，增强其低温耐受能力。