黑曲霉菌球形态对产酸影响

摘      要：以黑曲霉Co827菌株为试验菌株，通过不同培养基营养条件下菌球大小的测量统计分析，考察不同营养对菌球大小的影响。同时，以不同大小的菌球进行发酵培养，考察发酵转化率与菌球大小的关系。结果表明：种子罐培养菌球到菌球截面面积2 450～2 550 μm2，总糖120 g·L-1，其碳氮比35，氮磷比3.5为宜。发酵罐菌球截面面积控制在3 730～3 820 μm2之间时，发酵转化率比较理想。当种子罐菌球截面面积偏小或偏大时，可以降低发酵培养基中的碳氮比、氮磷比或提高发酵培养基中的碳氮比、氮磷比，使菌球大小向目标菌球大小靠近，可以得到理想转化率。

关  键  词：黑曲霉;菌球大小;发酵;碳氮比;氮磷比

中图分类号：Q81       文献标识码： A       文章编号： 1671-0460（2020）08-1689-05

Abstract： Aspergillus Niger strain Co827 was used as the test strain，and the measurement and statistical analysis of mycorrhizal size under different nutrient conditions in medium were conducted to investigate the effect of different nutrients on mycorrhizal size. At the same time，the relationship between fermentation conversion rate and bacterial pellet size was investigated. The results showed that： the cross section area from mycelial culture to mycelial culture was 2 450～2 550 μm2，the total sugar was 120 g·L-1， the carbon/nitrogen ratio was 35，the nitrogen/phosphorus ratio was 3.5. When the cross section area of the fermentation tank was controlled in the range of 3 730～3 820 μm2，the fermentation conversion rate was ideal. When the cross section area of mycelium in seed tank was small or large， the ratio of carbon to nitrogen and nitrogen to phosphorus in fermentation medium should be reduced or the ratio of carbon to nitrogen and nitrogen to phosphorus in fermentation medium should be increased，so that the size of mycelium can be close to the target size of mycelium， and the ideal conversion rate can be obtained.

Key words： Aspergillus niger; Mycelium size; Fermentation; C/ N ; N/P

柠檬酸，英文名citric acid，化学名称为2-羟基-均丙三羧酸，与其他羧酸有相似的物理和化学性质。加热至175 ℃时它会分解产生二氧化碳和水，剩余一些白色晶体。柠檬酸是一种中强酸，可以电离出3个H+，加热可以分解成多种产物，与酸、碱、甘油等发生反应。

柠檬酸最初在1784年由C.W.舍勒首先在水果榨汁中加入石灰乳以形成柠檬酸钙沉淀的方法制取柠檬酸的。1923年美国菲泽公司建造了世界上第一家以黑曲霉浅柠檬酸粉盘发酵法生产柠檬酸的工厂。1952年美国迈尔斯试验室采用深层发酵法大规模生产柠檬酸。近年来各厂家又纷纷在设备规模上进行扩大。柠檬酸已然发展为世界上用生物化学方法生产的产量最大的有机酸，是以淀粉质为原料，通过微生物发酵、提取纯化等手段而得到的一种有机酸。柠檬酸及盐类是发酵行业的支柱产品之一，在食品工业、精细化工、洗涤、医药以及動物养殖上具有广泛用途。

自21世纪以来，柠檬酸产业的竞争日趋激烈，许多小企业纷纷退出该领域，这使全球柠檬酸的生产和进出口更加集中。目前，我国柠檬酸产量已达到177万t·a-1，占全球产量的67%，是柠檬酸主要生产国和出口国。因此，我国的柠檬酸产能对全球柠檬酸市场具有举足轻重的作用。随着供给侧改革的深入行动，柠檬酸产业更应以创新驱动核心技术能力提升，把提高供给体系质量作为主攻方向，促进行业高质量发展。

黑曲霉，广泛分布于土壤、空气和谷物上，是重要的发酵工业菌种，是制酱、酿酒、制醋的主要菌种，也是生产酶制剂（蛋白酶、淀粉酶、果胶酶） 、有机酸（如柠檬酸、葡萄糖酸等）的菌种，农业上用作生产糖化饲料的菌种。它可用来测定锰、铜、钼、锌等微量元素和作为霉腐试验菌[1]。

在液体培养体系中，相较于细菌、酵母发酵过程，由于霉菌其独特的特性导致发酵培养过程中传质和传氧两大关键需求与菌体生长特性相背。黑曲霉需氧（dissolved oxygen）和传质（mass transfer）需要大搅拌转速，黑曲霉菌球生长过大则菌球内部缺氧、传质差;菌球过散或不成为菌球，则松散菌球或菌丝容易在搅拌的剪切力下破碎或断裂，都会影响黑曲霉发酵产酸。

1.4.4  菌球测量

取培养液加水稀释10倍，然后将稀释液1滴与载玻片上，盖上盖玻片，在显微镜上放大300倍，利用在线拍照软件中的测量功能，对视野里的菌球进行测量，测量分为两种：取两点测菌球直径和取三点为圆测菌球面积。菌球大小的数据取视野内所有菌球直径（面积）的平均值为该种子罐或发酵罐的菌球直径（面积）。本文中主要以镜头下菌球面积为分析点。

2  数据与分析

2.1  不同营养对菌球大小的影响

表3为种子罐正交摇瓶方差分析结果。在表3的菌球截面积方差分析结果中显示：碳氮比和氮磷比的极差值3.57和2.26远大于1.30，而糖浓度的极差值0.86小于1.30。因此，氮源和磷源含量对种子罐菌球的菌球截面积大小的影响很大。糖浓度对菌球截面积大小的影响较小。

同时，也通过比较分析得出：氮源含量越高菌球截面积越大，即菌球越大;磷源含量升高，对菌球截面积的影响次之。在一定范围内的糖浓度对菌球截面积大小的影响很小[5]。

根据上面得出的结论，以碳氮比为主要考察因素设计出的总糖11%、碳氮比（25、30、35、40）、氮磷比（3.2、3.5）为配方在5 L小罐上验证。得出菌球面积数据如表4。

图3再次验证了菌球的大小与碳氮比的关系密切，随着碳氮比的升高而减小，与氮磷比有相关，随着氮磷比的降低而增大，但氮磷比的影响没有碳氮比明显。

2.2  菌球大小对发酵结果的影响

2.2.1  菌球大小对转化率的影响

按照正交摇瓶配方培养的菌球液接入相同发酵培养基的摇瓶中，培养72 h的摇瓶菌球大小及产酸结果如图4。

从图4可以看出，摇瓶转速提高50 r·min-1对菌球大小没有改变，400 r·min-1和450 r·min-1摇瓶菌球大小和趋势基本一致。当摇瓶转速在400 r·min-1时，菌球面积在3 716 μm2和3 776 μm2时转化率达到了顶峰值。大于或小于该面积的转化率都偏低。当提高摇瓶转速至450 r·min-1时，对菌球面积小的没有影响，菌球面积大的，其转化率会有所提高，菌球面积3 941 μm2的转化率由92.46%提高到95.53%。

这是由于对小菌球而言，400 r·min-1的摇瓶转速已经足够其供氧和传质的需求了，再提高转速对其影响不大。然后，对于菌球偏大的，由于菌球直径增大，氧、营养等物料运输就要克服更大的阻力，因此提高转速对于大菌球有一定效果，但随着菌球的增大，其效果降低。

2.2.2  改变培养基营养对菌球大小和转化率的影响

按照1.4.3进行摇瓶发酵的结果如图5所示。

经过营养调整后，给予小面积的菌球以更加丰富的营养，给予大面积菌球以贫瘠一些的营养，经过发酵结束时的菌球大小测量发现，给予一定的营养后，菌球有不同程度的增大，营养丰富的菌球增大越加明显，经过调整以后，各摇瓶菌球面积之间的差距变小了。

同时，经过调整后，因菌球面积的变化，摇瓶转化率也发生了变化。小菌球因营养丰富增大后转化率也提高了，大菌球因营养减少也变得没有原来那么大了，转化率也提升了。

4组、8组、11组、12组、14组和15组这6组摇瓶得各自平均转化率均都在95%以上，4组、8组菌球增大，14组和15组菌球减小，调整后其菌球在3 730～3 820 μm2之间。其余10组菌球面积或大于3 820 μm2或小于3 720 μm2，其转化率均低于95%。

3  结果与讨论

3.1  营养对菌球大小的影响

对于黑曲霉柠檬酸发酵来说，菌球大小影响传氧和传质，而在供氧充足的情况影响菌球大小的主要因素为培养基的营养，而通过本实验说明，碳氮比是影响菌球大小的最显著因素，其次为氮磷比。营养过于丰富，则菌球增长过大，导致菌球内部氧气的供给和物料的传输困难。合適的碳氮比和氮磷比可以使菌球生长到合适的大小。

3.2  菌球大小对发酵转化率的影响

菌球大小一方面影响菌球本身的生长需要消耗碳源。另一方面，当菌球数量一定时，菌球过小时，菌体生物量低，产物合成速率慢，导致发酵周期延长;当菌球过大时，导致菌球内部供氧不足，在供氧不足的情况下，侧系呼吸链不同程度的失活，呼吸链发生偏转到常规呼吸链，常规呼吸链大量消耗碳源产生大量ATP抑制糖酵解途径通量使转化率大幅下降。菌球小是因为生物量不够，残糖高，转化率低;菌球过大是因为菌球生长和菌球内部供氧不足，导致大量产生能量消耗的碳源过多而转化率低。当菌球偏大时，提高供氧，在一定程度上可以提高发酵转化率。

4  结 论

本文主要研究了菌球大小与发酵转化率的关系，同时也研究了菌球大小与培养基之间的营养比例的关系。为了达到高速产酸和高收率，种子罐培养菌球到菌球截面面积2 450～2 550 μm2，总糖120 g·L-1，其碳氮比35，氮磷比3.5为宜。发酵罐菌球截面面积控制在3 730～3 820 μm2之间时，发酵转化率比较理想。在种子培养和发酵过程中，需要根据实际情况从多个角度采用动态理念进行调整[6]。当种子罐菌球截面面积偏小或偏大时，可以降低发酵培养基中的碳氮比、氮磷比或提高发酵培养基中的碳氮比、氮磷比，使菌球大小向理想菌球大小靠近。

参考文献：

[1]王博彦，金其荣. 发酵有机酸生产与应用手册[M]. 北京：中国轻工业出版社，2000.

[2]唐文俊，夏建业，储炬，等. 黑曲霉发酵过程中菌体形态的分析方法建立及应用[J]. 生物工程学报，2015（2）：291-299.

[3]王宝石，李林波，谭凤玲，等. 剪切力敏感型微生物形态塑造及其在柠檬酸发酵中的应用[J]. 食品与发酵工业，2018，44（12）：267-273.

[4]卢宗梅，周勇，杨儒文，等. 全清液发酵营养组学的精准控制[J].当代化工，2019，48（4）：830-833.

[5]张伟心，王建平. 有机氮源对柠檬酸发酵的影响[J]. 河北大学学报：自然科学版，2000（2）：157-162.

[6]张嗣良，储炬. 多尺度微生物过程优化[M]. 北京：化学工业出版社，2003.