正交试验优选逐瘀止痛远红外灸贴的醇提工艺
2020-09-09刘文静毕建云孙玉
刘文静 毕建云 孙玉
摘 要: 优选了逐瘀止痛远红外灸贴的醇提工艺。以桃仁中苦杏仁苷得率及干膏得率作为考察指标,在单因素实验基础上,采用正交设计选出逐瘀止痛远红外灸贴的醇提工艺。优选出的醇提工艺为:首先将生药浸泡1 h,后加入4倍药材量乙醇(70%,质量分数)(第二次同样加入4倍药材量乙醇(70%,质量分数)),以1.5 h作为每次的回流时间,进行2次回流提取,此时苦杏仁苷得率和干膏得率均优于其他提取条件。该工艺稳定可靠,省时节能,可以用作大规模生产。
关 键 词: 正交试验;逐瘀止痛;远红外灸贴;醇提工艺
中图分类号:TQ 016.1 文献标识码: A 文章编号: 1671-0460(2020)08-1622-04
Abstract:To optimize the alcohol extraction process of blood stasis and pain relieving far-infrared moxibustion sticker, taking the yield of amygdalin and the yield of dry paste in peach kernel as the indicators, based on the single factor experiment, the orthogonal design was used to optimize the alcohol extraction process. The preferred alcohol extraction process was determined as follows: the immersion time 1 h, 70% ethanol use amount 4 times of the quantity of medicinal materials (the second 70% ethanol use amount also was 4 times), each reflux extraction time 2 h ,and reflux extraction times 2 times. The process is stable and reliable, saves time and energy, and can be used in large scale production.
Key words:Orthogonal test; Pain relieving; Far-infrared moxibustion sticker; Alcohol extraction process
原发性痛经是一种妇科常见病。 常伴随腰酸腿痛、四肢无力、头晕恶心等症状。中医学认为:原发性痛经之病机在于“不通则痛”、“不荣则痛”虚实两端。中药活血化瘀药在改善疼痛的同时也改善了血液流变性, 可用于长期治疗,优势明显,前景广阔。逐瘀止痛灸贴方来自于血府逐瘀汤一方,由桃仁,当归、红花,赤芍等十一味中药组成。作为活血化瘀之要药,生桃仁及其醇提物可改善血液流变学。牛膝具有逐瘀通经的功效, 可有效治疗闭经、痛经等病症。生地黄善于逐血痹, 凉血活血, 养阴益津, 强健体质[1-2]。笔者选择桃仁中中苦杏仁苷的得率及干膏得率为指标, 优选出乙醇提取桃仁、生地黄、牛膝这三味药材的工艺条件。
1 实验部分
1.1 仪器
Agilent 1200高效液相色谱仪;GFL-230型恒温干燥箱;PL-S20型数码超声波提取器;FA2004B电子分析天平;多功能粉碎机。
1.2 药材与试剂
所用药材桃仁、牛膝、生地黄均购于山东百味堂中药饮片有限公司,经山东中医药大学实验中心战旗副教授鉴定,均符合2015版药典规定。硅藻土(批号:20180110);苦杏仁苷(批号:MUST-17022809);石油醚(批號:20190305);甲醇(批号:20131224),水为纯净水。
2 醇提工艺研究
桃仁、生地黄、牛膝采用乙醇提取,正交试验优选其醇提工艺,且将桃仁中苦杏仁苷得率和干膏得率作为考察指标。
2.1 苦杏仁苷的含量测定[3-7]
2.1.1 色谱条件
色谱柱:Inertsil ODS-3(4.6 mm×250 mm, 5μm);流动相:甲醇-水(20∶80);检测波长:210 nm;进样量:10μL;柱温:30 ℃;流速:1 mL·min-1。
2.1.2 苦杏仁苷样品溶液的制备
1)首先对桃仁进行脱脂:精确称量桃仁12 g,加100 mL石油醚完全没过药材,之后使温度维持在95 ℃进行加热回流1 h,冷却后滤过。弃去滤液,挥干石油醚后的药渣和滤纸备用。
2)按照处方比例精密称取桃仁(已脱脂)12 g、生地黄9 g、牛膝9 g的醇提药材共30 g,加6倍量70%乙醇,加热回流提取2次,每次1 h,放冷,滤过,合并续滤液,于500 mL容量瓶中用质量分数70%乙醇稀释至刻度。精密量取25 mL,蒸至小体积,加入2.5 g硅藻土拌匀,干燥,研细,置于锥形瓶内,精密量取50 mL甲醇,与锥形瓶内物质混合,进而超声振荡处理(功率120 W,频率40 000 Hz)20 min,过滤,舍弃初滤液,保留续滤液并用0.45 μm滤膜对其滤过,即得。
2.1.3 苦杏仁苷对照液的制备
精确称量苦杏仁苷标准品,用70%甲醇溶液制得浓度为0.275 mg·mL-1的标准品溶液。
2.1.4 缺桃仁阴性对照液的制备
按处方比例称取生地黄和牛膝各9 g,按照2.1.2所示方法,制得缺桃仁阴性对照溶液。
2.1.5 线性关系考察
将2.1.3项下的对照品溶液依次取0.5、1、2、4、6、8、10、15 μL进样,在2.1.1的条件下测其对应的峰面积积分值,结合进样量(μg)为横坐标,峰面积(A)为纵坐标绘制标准曲线,并对苦杏仁苷进行线性关系的考察。根據实验数据得:苦杏仁苷在0.137 5~4.125 0 μg范围内有良好的线性关系。计算得苦杏仁苷的回归方程为Y=1 114.43X+122.04 ,相关系数r=0.999。结果见表1。标准曲线见图1。
2.1.6 空白干扰实验
精密吸取对照品液、供试品液、缺桃仁的阴性对照液各10μL,在2.1.1项色谱条件下进行检测。结果显示相同的保留时间下,对照品液与供试品液均有较好的色谱峰, 缺桃仁阴性对照液在相应的位置无峰。说明该测定方法的专属性好。见图2。
2.1.7 精密度试验
按照每针10μL的标准,连续取2.1.2项下的供试品溶液,进样6针,峰面积积分值RSD为1.646%。表明该方法下仪器精密度良好。
2.1.8 稳定性试验
按照每针10μL的标准,精密吸取2.1.2项下的供试品溶液,在0、2、4、6、8、24 h各进样一次,在2.1.1色谱条件下,检测对应时刻峰面积积分分值,得RSD为1.548%,这表明24 h内苦杏仁苷不产生明显变化,判为稳定。
2.1.9 重复性试验
平行精密量取2.1.2项下的提取液6份,各25 mL,遵循上述方法制备供试液并测定苦杏仁苷的含量,RSD值为1.35%。表明利用此方法可行,重复性良好。
2.1.10 加样回收率试验
平行精密移取已知苦杏仁苷含量的供试品液6份,各12.5 mL,分别加入苦杏仁苷对照品液13 mg,混合至均匀,按照2.1.2项下方法制备供试液,并按照含量测定项下方法测定苦杏仁苷含量,结果见表2。
2.2 正交试验优选醇提工艺路线
2.2.1 粉碎粒度考察
药材粉碎粒度与有效成分溶出率之间有着密切联系。按照处方比例分别称取不粉碎药材饮片、过10目(1 700 μm)、20目(830 μm)筛的桃仁(预先用石油醚脱脂)12 g、生地黄9 g、牛膝9 g,加6倍量70%乙醇加热回流提取2次,每次1 h,按照2.1.2的方法,测定苦杏仁苷得率。结果过20目(830μm)筛的药材颗粒中苦杏仁苷的得率最高(22.73>17.94> 13.33 mg·g-1)。因此,选择粉碎后过20目(830μm)筛的药材。
2.2.2 醇浓度考察
按照处方比例称取过20目(830μm)筛的桃仁(预先用石油醚脱脂)12 g、生地黄9 g、牛膝9 g,按照6倍药材量进行量取乙醇,分别加入60%、70%、80%三种规格的乙醇进行回流,每次1 h,提取2次。遵循2.1.2的方法,继而获得苦杏仁苷得率。结果发现苦杏仁苷得率在70%乙醇质量分数下为最高(22.73> 21.43>21.19 mg·g-1),从而确定提取醇质量分数为70%。
2.2.3 因素与水平
在粉碎粒度、醇浓度单因素考察的基础上,考查加醇量、提取时间、回流次数三个因素,且每个因素各取3个水平,选用L9(34)正交表安排实验,因素水平设置见表3。
2.2.4 试验安排及结果
按处方比例称取桃仁(预先使用石油醚脱脂)12、生地9、牛膝9的醇提药材过20目(830μm)筛共计30,预先用相应量的70%乙醇浸泡1 h, 按照正交试验表安排试验。将苦杏仁苷得率与干膏得率两者在直观分析的基础上进行方差分析,结果见表4和表5。
直观分析发现,提取时间1.5 h与2 h提取的苦杏仁苷的得率相近,从干膏得率可以看出1.5 h要远大于2 h,所以选择1.5 h;提取次数,提取2次苦杏仁苷的得率与3次相近,干膏得率两者也相近且远大于提取1次,所以选择提取2次;加醇量4倍的苦杏仁苷的得率与8倍的得率相近,干膏得率4倍量的远大于6倍量与8倍量,从省时节能的角度看出选择加4倍量乙醇(70%,质量分数)。从方差分析可以看出,对于苦杏仁苷得率的影响程度依次为C>A>B,即回流次数>加醇量>提取时间,以省时节能为角度,确定最佳提取工艺为A3B2C2。即加入4倍量乙醇(70%,质量分数)(第二次同样加入4倍量乙醇(70%,质量分数)),回流提取2次,每次1.5 h。
2.3 醇提工艺验证性试验
按上述优化的条件,平行进行3次验证试验,苦杏仁苷的得率分别为22.07、21.77、22.24 mg·g-1,平均值为22.03 mg·g-1,RSD值为1.09 %。苦杏仁苷的干膏得率依次为45.07%、45.41%、45.32% ,得平均值为45.27%,RSD为0.38%。表明工艺稳定可行,可进行中试验证。
3 讨论
苦杏仁苷是桃仁所含苷类中的主要有效成分,桃仁作为君药,在实验过程中需精密称定,因含有大量油脂,故预先使用石油醚脱脂。梓醇是地黄环烯醚萜苷中的主要成分之一,也是地黄的指标成分[8]。笔者曾试图也将梓醇作为醇提药材HPLC图的指标成分,但并未得到理想结果。牛膝主要含甾酮类、皂苷类及多糖类化合物 [9]。三种药材采用醇提法,经济实惠,操作简便,无污染。单因素实验考察醇浓度对于苦杏仁苷得率的影响时,在60%~70%范围内,苦杏仁苷得率与醇浓度成正比,这可能是因其含有大量的酚羟基,根据相似相溶的原理,溶解度变大[10]。在70%~80%范围内,苦杏仁苷得率与醇浓度呈反比趋势,初步猜测为乙醇浓度变高的同时,桃仁中一些醇溶性杂质或强亲脂性成分的溶出量也在增加,从而降低了苦杏仁苷的得率[11]。
参考文献:
[1]肖雯晖,王香桂. 中药巴布剂治疗痛经的主要药效学实验研究[J].中国实验方剂学杂志,2005,11(5):52-54.
[2]刘双萍,董娟娟,张小花,等.活血行气化瘀药组方治疗气滞血瘀型原发性痛经30例临床观察[J].甘肃中医药大学学报,2017,34(01):45-47.
[3]韦志英,杨志丽,陆海琳,等.HPLC法测定桃仁配方颗粒中苦杏仁苷的含量[J].广西中医学院学报,2010,13(04):49-50.
[4]钱平,刘志辉,钱芳,等.桃仁定性鉴别与含量测定研究[J].中国药事,2010,24(04):351-353.
[5]王友兰,李红兵,华玉琴.HPLC法测定桃仁中苦杏仁苷的含量[J].中国药师,2002(09):550-556.
[6]云琦,马小华,高晓黎,等.新疆桃仁中苦杏仁苷含量测定新方法研究[J].中国药品标准,2013,14(06):433-436.
[7]权彦,何建军,刘靖丽,孟庆华,宋逍.水提醇沉法提取黄芪中黄芪多糖的工艺优化及含量测定[J].当代化工,2018,47(07):1374-1376.
[8]郭阿莉.不同炮制方法对地黄化学成分及药理作用的影响[J].中国民间疗法,2019,27(04):86-88.
[9]胡婷婷,张振凌.中药牛膝化学成分、药理作用及储藏保管[J].中国老年学杂志,2016,36(13):3321-3322.
[10]谢朝晖,李鑫,李文博,等.超声波法提取山杏仁中苦杏仁苷的单因素试验研究[J].河南城建学院学报,2012,21(02):31-38.
[11]王万能,全学军,陆天健.超声波循环提取桔皮总黄酮的研究[J].中成药,2007(02):279-281.