煤污病害对灰金竹叶片光合及生理生态特性的影响

2020-09-09刘蔚漪辉朝茂刘广路刘国武罗选航刘永娇

林业科学研究 2020年4期

刘蔚漪，辉朝茂，刘广路，刘国武，罗选航，刘永娇

(1. 西南林业大学，丛生竹工程技术研究中心，云南昆明 650224；2. 国际竹藤中心，竹藤科学与技术重点实验室，北京 100102；

3. 昆明市东川区二二二林场，云南昆明 654106)

灰金竹（Phyllostachys nigravar.henonis（Mitford）Stapf. ex Rendle），又名毛金竹，粉金竹，为云南分布最广、栽培面积最大的竹亚科刚竹属大型散生竹种。由于其耐寒耐旱，在园林上应用较为广泛，但易被煤污病害侵染，一旦染病，病叶光合作用受阻，病竹营养不良，致使竹林生长衰弱，将严重降低其观赏价值。园林植物的光合生理特性与其自身的遗传特性和周围的环境因素紧密相关，是植物栽培过程中重要的依据指标之一[1]。关于竹类植物光合特性的研究，有酸雨胁迫[2]、施肥梯度[3]、CO2浓度和光照强度变化[4]等不同处理的研究，且研究的竹种也各不相同。一些研究表明竹子在受到胁迫时，净光合速率（Pn）日进程会发生变化[2]，如未经酸雨胁迫的箬竹（Indocalamus tessellatusKeng f.）叶片Pn呈不明显的“双峰型”（近似“单峰型”），而在酸雨胁迫下则表现出明显的“双峰型”。但是竹类植物是一个非常复杂的类群，散生竹和丛生竹之间，其生物学特性差别甚大，即使是同一属的竹子，不同竹种的植株大小、叶片大小、生活习性、光合特性等也有很大的差异。一些未受到胁迫的竹种Pn日变化规律也会表现出“双峰型”曲线，如4种地被竹：铺地竹（Sasa argenteastriatusE.G.Camus）、菲白竹（Sasa fortune（Van Houtte) Fiori）、鹅毛竹（ShibataeachinensisNakai）和黄条金刚竹（Pleioblastus kongosanensisf. aureostriatus）[5]，常见的笋用竹Pn日变化规律也会表现出“双峰型”曲线，如慈竹（Neosinocalamus affinins（Rendle) McClure）、梁山慈竹（Dendroclamus farinosus（Keng et Keng.f.）Chia et H. L. Fung）、桂竹（P. bambusoidesSieb. et Zucc.）和刚竹（P. sulphurea（Carr.）A.'Viridis'）等[6]，以及云南大型的牡竹属竹种，如云南甜龙竹（D. brandisii（Munro）Kurz）、龙竹（D. giganteusMunro.）和野龙竹（D.semiscandensHsueh et D. Z. Li）[7]。因不同竹种的光合生理特性差异较大，且影响光合作用的主要因素也各不相同，甚至竹叶的颜色由于叶绿素含量等存在差异[8]，竹子在受到病虫害胁迫时光合特性会发生怎样的变化是值得探索的问题。研究已经证实，植物衰老的过程同时也是活性氧代谢失调积累的过程[9]，当竹子感染煤污病后，竹子叶片细胞的酶功能是否会发生紊乱？植株的光能利用率和CO2同化是否会受到抑制？从而是否会影响植株的发育进程和生长状况？这些都是未知的。

竹煤污病又称竹煤病、竹煤烟病，病原为小煤炱菌（Meliolasp.）和煤炱菌（Caodiumspp.）。蚜虫和蚧壳虫在竹枝叶上分泌出含糖甜味的黏液后[10]，病原孢子落在上面而形成灰黑色如煤污状的物质[11]，引起植物发病。该病在我国各竹区的多种竹子上均有发生[11]。病害初期，叶片正面有黑色烟煤状病斑出现，有的沿主脉扩展，以后逐渐增多，连接成片，使整个叶面、嫩梢上布满黑霉层，阻碍叶片进行光合作用，染病植株营养不良、生长缓慢，叶片提早凋落，从外形上，竹林灰蒙蒙，死气沉沉，严重影响其观赏价值和经济价值。本研究以感染煤污病的灰金竹为研究对象，试图通过分析染病后灰金竹光合特性、生理特性及立竹指标和生物量等因子，综合评价煤污病对灰金竹的影响，为灰金竹的栽培和管理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验在云南省西南林业大学珍稀特有竹种园进行，该园始建于1991年，占地面积1.3余hm2，是薛纪如先生亲手组建，共引种云南及周边地区各种珍稀特有和经济竹种160余种，经过几年引种栽培，形成一定规模。该竹园位于云南省昆明市东北方向，102°45′ E、25°4′ N，海拔1 920 m。昆明市年平均温度为14.7℃，最高温度为31.5℃，大于10℃的活动积温为4 479.7℃，年平均降水量为1 011.8 mm，主要集中于5—10月份，为全年降水量的88.45%，年平均蒸发量为1 867.7 mm，干湿季明显，气候主要受西南季风大陆气团的影响，春、冬季常为旱季。

1.2 灰金竹生物学和生态学特性

灰金竹原产我国黄河流域以南地区，是刚竹属自然分布最广的竹种之一，西起云南、贵州，东迄江苏沿海，北至陕西、河南。日本、欧洲及美洲均有引种栽培。垂直分布在海拔50～1 500 m。灰金竹的地下茎属单轴型。与原变种的区别在于秆绿色，不变为紫黑色，形体较为粗大。竿高6～15 m，直径4～10 cm。地下鞭根系统主要分布于0～20 cm土层中，地下鞭芽数量为1 028.7个·m-2[12]。竹笋淡红褐色或带褐色，在平均气温15℃以上时开始出土，到高生长结束需13～22天[13]。通常是在3月上旬至4月中旬开始发笋，到5月上旬出笋结束，6月上旬抽枝长叶，7—9月大量长鞭，12月后生理活动逐渐缓慢，翌年2月中旬萌发叶芽，生理活动恢复。适应性和抗逆性均强。具有较强的耐寒性，能耐-20℃低温；较耐干旱瘠薄，喜欢深厚肥沃、排水良好的土壤，忌排水不良的低洼地，主要病虫害为黑粉病[14]。

1.3 试验方法

（1）光合指标测定。染病竹林与正常竹林的林分结构、立地条件基本一致，于2016年10月18日（晴天），在染病竹林与正常竹林分别选择2年生植株各3株，每株选取向阳面、面积相当的叶片各1片进行标记，利用自然光照，从8:30—17:30时每隔1 h测定1次，并重复3次取平均值。Li-6400XT便携式光合系统自动记录光合指标，使用开放式气路，空气流速为500 s·m-3，大气压为100 KPa，叶室面积为2 cm×3 cm。

（2）比叶质量测定。在竹秆中部靠外围方向的枝条上，各取50片1年生的成熟叶片，10片竹叶为1组，重复5次，用游标卡尺（精确到0.02 mm）以测量叶片厚度。再用打孔器从50片叶中部打取100个圆片，直径0.6 cm，在80℃的温度下持续烘干，直到称量变化不明显为止，测得其最后干质量，计算其比叶质量。

（3）叶绿素及生理指标测定。为反映正常灰金竹感染竹煤污病后的叶片衰退情况，从2016年6—10月，测定5个月内可溶性蛋白（SP）、超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）、叶绿素含量的变化情况。SP测定：称取鲜样0.2 g，采用考马斯亮蓝法，在595 nm波长下比色测定吸光度，通过标准曲线获得蛋白质含量[15]。SOD、MDA提取参考乔匀周文献[9]。叶绿素含量用浸提法测定[6]，选取试验植株中部外围枝的成熟叶片，用清水洗净、擦干、剪碎（面积约1 mm2），随机取样称取0.25 g（精确到0.01 g）放入试管中，用浸提液（丙酮∶乙醇∶蒸馏水体积比=4.5∶4.5∶1.0）定容至20 mL在暗处静置36 h，以浸提液为空白对照，用紫外分光光度计分别测得叶绿素提取液的吸光值A649和A665，利用叶绿素含量计算公式进行计算。

（4）立竹构件与生物量测定。分别从正常和染病的竹林中选取2年生样竹各20株，保证径级一致，齐地伐倒后逐株测量立竹胸径、地径、全高、枝下高、100 cm长度竹秆的上端壁厚和上端直径等指标，再计算立竹平均壁厚率（壁厚率=上端壁厚/上端直径）。同时分别称量竹秆、竹枝和竹叶的鲜质量，取样竹5株，分离竹秆、竹枝及竹叶，105℃杀青后，85℃下烘干至恒质量，计算各器官的生物量[16]。

1.4 数据分析

数据采用Microsoft Excel 2007和SPSS软件进行方差分析和图表处理。

2 结果与分析

2.1 叶片Pn值日变化

Pn值与竹子同化物生产能力正相关[17]。由图1可知，染病灰金竹的Pn值低于正常灰金竹，两者变化趋势一致，分别在上午10:30和15:30出现两次峰值，“午休”现象明显。上午8:00—10:30叶片Pn值随着光照强度的增加呈上升趋势，并且在10:30出现全天第1个高峰值，随着光照强度和气温的继续升高，光合速率下降，在13:30—14:30之间出现光合速率的最低值，正常灰金竹的下降幅度为77.70%，染病灰金竹的下降幅度为80.72%，随着光照强度减弱，Pn值回升，在15:30左右又出现1个高峰，正常灰金竹的第2高峰值为第1峰值的64.39%，染病灰金竹的第2峰值为于第1峰值的67.32%。染病灰金竹的叶片附着一层煤烟状物质，使叶片对环境温度、光合有效辐射的变化反应迟钝，降低了其对光能利用的潜力，染病灰金竹的Pn日最大值低于正常灰金竹的Pn日最大值，Pn日均值低于正常灰金竹的Pn日均值。

图1 正常和染病灰金竹的Pn日变化Fig. 1 Diurnal variation of net photosynthetic rate of healthy and infected p. nigra var henonis

2.2 叶片光合和气体交换参数的日变化规律

由图2可知，光合有效辐射和大气温度的变化趋势一致，大气温度的降低稍微滞后太阳有效辐射。正常与染病灰金竹两者的气孔导度（Cond）、胞间CO2浓度（Ci）以及蒸腾速率（Tr）的变化趋势基本一致，峰值的出现点也基本一致。Cond分别在10:30和15:30出现2个峰点，Ci随着时间的推移都在逐渐减低，下午16:30后回升，两者Tr值均在中午12:30达到最大值，之后逐渐减低。总的来说，染病灰金竹Cond、Tr值都要比正常灰金竹的低。Cond值低到48%～68%，Tr值低到50%～70%。但是就Ci来看，染病灰金竹比正常灰金竹的值高，平均高出18%左右，两者的变化趋势基本一致，随着时间的推移逐渐降低，但16:30后，有上升趋势。

2.3 叶片光合特性相关性分析

染病灰金竹Pn值低于正常灰金竹，分析光合作用中Pn与其他影响因子相关性，可以找出染病后的灰金竹光合作用中的关键影响因素。正常和染病灰金竹光合特性多元回归分析见表1。

图2 正常和染病灰金竹叶片气体交换参数的日变化曲线Fig. 2 Diurnal change curves of gas exchange parameters of leaf of healthy and infected p. nigra var henonis tested

表1 正常灰金竹和染病灰金竹Pn值与影响因子的相关关系矩阵Table 1 Correlations analysis of photosynthetic rate and other factors on healthy and infected P. nigra var henonis

由表1可知，正常灰金竹Pn与Cond、Tr、PAR呈极显著正相关（P＜0.01），相关系数分别为0.732、0.599、0.800，其中PAR与Pn的相关系数最大，PAR是影响Pn的主导因子。Pn与气温（Ta）呈显著相关（P＜0.05），而Ta又与PAR极显著正相关。Ci与PAR极显著负相关（P＜0.01），与Pn呈显著相关（P＜0.05）。由表1可知，染病灰金竹Ci与Ca、Pn呈极显著负相关（P＜0.01），相关系数分别为-0.592、-0.631，Cond与Tr呈极显著正相关（P＜0.01），Tr又与Ta、RH和PAR呈极显著正相关（P＜0.01）。影响染病灰金竹Pn的主导因子是Ci和Ca。

2.4 生长季叶绿素含量及生理指标的变化趋势

叶绿素作为光合色素，参与光合作用中光能的吸收、传递和转化，其含量与比值是衡量植物是否适应环境的重要指标之一[18]。由表2可知：正常灰金竹的叶片厚度（1.10 mm）和染病灰金竹叶片厚度（1.12 mm）无显著差异；正常灰金竹的比叶质量（0.57 g·cm-2）显著（P＜0.05）小于染病灰金竹的比叶质量（0.66 g·cm-2）；正常灰金竹叶片的叶绿素a（1.06 mg·g-1）、叶绿素b（2.03 mg·g-1）含量及叶绿素总量（mg·g-1）都极显著（P＜0.01）小于染病灰金竹的叶绿素a（1.21 mg·g-1）、叶绿素b（2.69 mg·g-1）含量及叶绿素总量（3.90 mg·g-1）。

表2 正常灰金竹和染病灰金竹部分生理特征Table 2 Physiological and photosynthetic characters for healthy and infected P. nigra var henonis

由表3可知，灰金竹叶绿素总量、可溶性蛋白含量、超氧化物歧化酶活性、丙二醛4个生理指标在生长季（6—10月）的变化情况。染病灰金竹叶绿素总量始终比正常灰金竹高，随时间推移，叶绿素总量逐渐减低，染病灰金竹叶绿素总量的下降速度要高于正常灰金竹。进入9月份后，染病灰金竹叶绿素总量显著下降，下降率达到32%，而此时正常灰金竹叶绿素总量下降率只有11%。进入10月后，染病灰金竹叶绿素继续以40%的速度迅速下降，而正常灰金竹叶绿素下降的速度相对平缓，只有22%，正常灰金竹叶绿素总量随着时间的变化各月份之间的差异不显著（P＞0.05），而与染病灰金竹的叶绿素总量差异显著（P＜0.05）。

可溶性蛋白（SP）是光合作用酶以及电子传递体和光合色素的主要成分[4]。由表3可知，从6月份到10月份，正常灰金竹与染病灰金竹叶片可溶性蛋白含量随着时间的变化各月份之间的差异显著（P＜0.05），染病灰金竹叶片SP含量始终较正常灰金竹的叶片低，且差异显著（P＜0.05），两者SP都随时间推移呈下降趋势，反应了叶片的衰退的过程，尤其是进入9月份后，叶片衰退的速度加快，染病灰金竹叶片的衰退速度明显高于正常灰金竹的叶片，进入10月后，染病灰金竹叶片的SP比6月份下降了49%。

超氧化物歧化酶(SOD)是植物体内清除或减少自由基的重要保护酶之一，具有特殊的生理活性，是生物体内清除自由基的首要物质[19]。由表3可知，正常的与染病的灰金竹，其叶片的SOD值都随着衰老进程的推进而迅速地降低，而在这个过程中，染病灰金竹叶片SOD值始终高于正常灰金竹1～2倍，且差异显著（P＜0.05），并且下降的速率要大于正常灰金竹，从生长初期到生长末期，SOD值下降了65%。

丙二醛（MDA）是植物膜脂过氧化产物，其含量与质膜被破坏的程度直接相关，是膜系统受害的重要标志之一，MDA值越高说明植物细胞膜脂过氧化越严重。在叶片的衰老过程中观测MDA值的变化，可以直接反应叶片衰老的速度和受胁迫的程度[19]。由表3可知，在生长季，正常和染病的灰金竹，其叶片的MDA值都随着时间的变化而持续升高，进入生长末期，染病灰金竹MDA值比初期升高了近100%，而每个时期，染病灰金竹叶MDA含量始终比正常灰金竹高出20%～53%，其中初期和末期高出的比例值更大分别为53%和38%。

表3 正常灰金竹和染病灰金竹生理指标的变化情况Table 3 The variation of physiological indicators of healthy and infected P. nigra var henonis

2.5 立竹构件与生物量比较

从表4可知，正常灰金竹立竹指标均比染病灰金竹的立竹指标大，除地径和枝下高两个值差异不显著外，胸径、全株高和厚壁率差异显著（P＜0.05）。研究表明立竹的竹壁厚度可以反映气候条件（温度、湿度）、立地条件、竹林经营类型和竹林经营水平等因子差异[20]。从表4可知，正常灰金竹和染病灰金竹的厚壁率差异显著，正常灰金竹厚壁率（0.34±0.18）大于染病灰金竹的厚壁率（0.26±0.12）。

植物初级生产力的重要组成部分是生物量，为适应异质环境，保证生存和生长，植物个体不仅会改变表型特征及生长特性，而且会最大潜能地有效分配各器官之间的生物量[21]。从表4可知，正常灰金竹的单株地上生物量（1 711.20±186.38 g）要显著大于染病灰金竹（1 512.54±146.62 g），正常灰金竹的秆、枝、叶生物量也均显著大于染病灰金竹（P＜0.05）。正常灰金竹不同器官生物量分配比率分别为秆52.27%，枝37.34%，叶10.39%，染病灰金竹不同器官生物量分配比率分别为秆51.60%，枝37.94%，叶10.46%，两者差异不显著（P＞0.05）。

表4 正常灰金竹和染病灰金竹立竹构件与生物量比较Table 4 Biomass aboveground parts and modules of healthy and infected P. nigra var henonis

3 讨论

（1）本试验结果表明，煤污病可显著影响灰金竹的光合作用，导致灰金竹Pn、Cond、Tr和SP等明显降低，却增加了Ci和叶绿素含量，分析原因可知，病害降低叶片光合能力的机理主要包括2个层面。

第一层面，病害通过降低Cond，从而减少进入气孔的CO2量，进而降低了Pn[22-23]。本研究中染病灰金竹比正常灰金竹的光合速率低，通过分析光合作用中各因素的相关性，正常灰金竹光合速率与Cond是呈极显著正相关（P＜0.01）的，也就印证了第一个层面。染病后的灰金竹Cond降低，Pn降低，其光合产物就降低，长此以往，染病灰金竹的生长状况受到影响。与此同时，当气孔活动受到抑制时，也会严重阻碍蒸腾作用。一方面Tr与Cond呈正相关，较高的Tr有利于根部无机营养的快速运转，间接刺激了光合作用。另一方面，竹子生长的环境一般水分充足，高的Tr促进了竹子的光合作用[17]，染病灰金竹的Tr降低，破坏植物体内水分平衡，造成净光合速率降低，所以染病灰金竹的Tr要显著低于正常灰金竹（50%～70%）。正常灰金竹Ci比染病灰金竹低，随着时间的推移逐渐降低，但是16:30后，有上升的趋势。表明病变导致叶片呼吸作用增加，在抑制光合作用的同时造成净光合产物分解，这与前人的研究结果一致[22,24]。通过分析光合作用中各因素的相关性，染病灰金竹Ci、Ca与Pn呈极显著负相关（P＜0.01），也说明了这一点。Ca的升高，导致细胞Ci的增加，植物为保持胞间CO2分压始终低于大气CO2分压（20%～30%），必须降低气孔开闭程度，从而降低Cond，进而减少Ci[25]，以保证光合作用的进行。

第二层面，病害在改变光合作用的同时还影响叶片代谢功能，如呼吸作用增加，抑制光合电子传递，减少光合有效色素含量或降低酶活性，侵染宿主细胞引起溶质改变等[25]。通常情况下植物被病虫害侵染后，叶绿素含量会呈现降低趋势[26]。本研究中染病后的灰金竹光合有效色素含量高于正常灰金竹，这一点和机理的第二个层面有冲突，分析原因，有两种可能性。其一，与叶片的受损程度有关系，其他植物在受到病害后叶片会发黄、会溃烂，而灰金竹感染煤污病后，叶片并不会发生这些病变。叶片完好无损，降低了叶绿素流失的可能性，其二，可能是染病灰金竹通过增加叶绿素a来将光能转化为化学能。研究表明，植物能够通过控制太阳能到化学能转换的效率来适应光环境的变化[27]。通常情况下，在弱光下生长的植物叶片叶绿素含量会增加，以便增加光捕获[28]，从而提高水分利用效率，改善营养状况[29]。染病灰金竹因为叶片被黑色的煤粉覆盖，就好像给叶片搭了一个遮阴棚，使叶片处于阴暗的环境中，在有限的光照条件下染病灰金竹为保持光合作用的正常进行，就必须增加能捕获光的叶绿素，所以试验结果显示染病后，灰金竹叶片的叶绿素总量会显著高于正常灰金竹。

在生长季节6—10月份，正常和染病灰金竹叶绿素总量都在降低，随着时间的推移，天气逐渐寒冷，光照减弱，染病灰金竹叶绿素总量下降的速度和比例要高于正常灰金竹，说明染病灰金竹叶片病变后，其抗逆性已逐渐降低，因此对气候变化的响应更加敏感。在生长期间，正常灰金竹叶片SP始终高于染病灰金竹，进一步说明正常灰金竹具有较强的光合生理生化特性。且随着时间推移，叶片的叶绿素和SP降低的速率增加，衰退的速度增加，这一点和病害降低叶片光合能力的机理第二个层一致，与冷寒冰等人[15]的研究结果一致。

（2）灰金竹感染煤污病后，光合速率下降，叶片衰退速度加快，将光能转化为化学能的机能下降，长此以往，染病竹林不仅在外观上受到影响，整个竹林也将逐渐衰败。在灰金竹的生长期，叶片的可溶性蛋白、超氧化物歧化酶活性都随着叶片衰退的进程而递减，且递减的速率都要高于正常灰金竹，而SOD值随着衰退的进程而递增，SOD值增加说明染病植株可能是想通过消耗大量SOD消除氧自由基对植株的伤害，这与植物在遭受胁迫时，会增加抗氧酶活性以消除胁迫因子的氧化作用原理一致[30]。通过对比分析正常灰金竹和染病灰金竹的立竹构件与生物量因子可以知道，正常灰金竹的植株个体要比染病灰金竹健壮，单株生物量更高。植物为了抵御病虫侵害，会加快次生代谢合成进度，进而影响到光合产物积累为碳水化合物的过程，进而影响到植株的生长[31]。这也说明，一旦灰金竹染病后，煤污覆盖叶片后，叶片生理指标受到影响，光合作用降低，从而减少生物量的积累[32]。因此对于染病的灰金竹，除了进行必要的化学防治以外，还应对竹林进行必要的修剪，保持适当的密度，以保证通风透光，减少病害的发生。透光率是影响林下植被生存和生长的潜在因素，林内光照的改变会引起林下植被种类、数量、生物量等的变化[33]。对于灰金竹煤污病的治疗来说，减少林分密度，增加透光度是十分必要的措施。