不同沙棘品种种子中α-亚麻酸含量差异及相关基因分析

张 彤，吕中睿，魏继华，张国昀，罗红梅，何彩云＊

(1. 中国林业科学研究院林业研究所，国家林业和草原局林木培育重点实验室，北京 100091；2. 中国林业科学研究院沙漠林业实验中心，内蒙古 磴口 015200)

沙棘(Hippophae rhamnoidesL.)是胡颓子科沙棘属的一种雌雄异株的灌木或小乔木，耐旱性和耐寒性良好。沙棘果实具有独特的药用和营养价值，在中国和俄罗斯有上百年的药用历史[1]。沙棘果实富含维生素、有机酸、氨基酸、脂肪酸、抗氧化剂和类黄酮[2-4]，在炎症性疾病、肝脏性疾病、动脉粥样硬化等疾病的治疗以及保护心脏等方面具有显著功效[5]。在沙棘种子含有的众多脂肪酸中，α-亚麻酸（α-Linolenic acid，C18:3N3）的含量十分丰富，且α-亚麻酸对大脑发育、心血管健康、炎症治疗等都具有重要作用[6-9]，但α-亚麻酸是人体必需脂肪酸，不能在人体内合成，只能通过食物摄取。豆油、花生油等常见植物食用油中的主要脂肪酸为油酸、亚油酸、棕榈酸和硬脂酸[10-11]，α-亚麻酸含量极低，而沙棘中高积累20.3%～36.3%的α-亚麻酸[12]，并且沙棘作为耐旱木本植物可以在沙地、荒山、盐碱地等边际土地生长，可避免与大田油料作物争夺土地，是理想的α-亚麻酸供给对象。

目前，油料作物脂肪酸合成途径及调控基因的研究较多，在沙棘的相关研究中多围绕脂肪酸组分及脂肪酸测定方法展开，少有针对沙棘中α-亚麻酸合成机制的研究。本研究选取α-亚麻酸含量存在差异的2个沙棘品种种子，对其含量差异及相关基因进行分析，在基因表达水平上研究沙棘中α-亚麻酸合成及代谢规律，为培育高α-亚麻酸含量的沙棘良种奠定理论基础。

1 实验材料

沙棘种子采自中国林业科学研究院沙漠林业实验中心（内蒙古磴口县），2个沙棘品种——蒙古大果沙棘向阳（Hippophae rhamnoides‘Mongolia’）（XY）和中国沙棘丰宁（H. rhamnoides‘Sinensis’）（FN）的种子分别采自3个不同的发育时期，依次为未成熟期（T1）、半成熟期(T2)和成熟期(T3)，在这3个时期沙棘种子的种皮颜色依次呈现为白色、黑白相间斑点色、黑色。因沙棘种皮与果皮的转色期基本一致，为保证时期界定更加精准，同时利用色差计测量沙棘果皮的红绿色指标 a 值和黄蓝指标 b 值，计算色泽比（h=a/b），种皮呈白色且果皮h值介于-0.18～-0.10的界定为T1时期，种皮呈黑白相间斑点色且果皮h值介于0.20～0.28的界定为T2时期，种皮呈黑色且果皮h值介于0.52～0.60的界定为T3时期。沙棘果实采集后快速将种子从果实中剥离，放入液氮中进行速冻，然后转移至-80℃冰箱长久保存，用于下一步分析。

2 实验方法

2.1 脂肪酸提取

将样品冰上解冻，取50 mg样品于2 mL离心管中。加入1 mL的氯仿甲醇(2:1 v/v)溶液，超声30 min。取上清液，加入1%硫酸甲醇溶液2 mL，80℃水浴，甲酯化30 min，随后加入1 mL的正己烷萃取，5 mL的纯水洗涤。吸取上清液500 μL，加入25 μL的水杨酸甲酯（500 mg·L-1）作为内标，混匀加入进样瓶，进样量1 μL，分流比 10∶1，分流进样，进行GC-MS 检测。

2.2 色谱-质谱分析

样品采用 AgilentDB-WAX 毛细管柱(30 m×0.25 mmID×0.25 μm)气相色谱系统进行分离。程序升温：初始温度为 50℃，保持 3 min，随后以10℃·min-1的速度升温至220℃并维持 20 min。载气为氦气，载气流速1.0 mL·min-1。样本队列中每间隔6个实验样本设置1个QC样本，用于检测和评价系统的稳定性及重复性。采用 Agilent7890A/5975C 气-质联用仪进行质谱分析。进样口温度280℃，离子源温度230℃，传输线温度250℃。电子轰击电离（EI）源，SIM 扫描方式，电子能量70 eV。采用 MSDChemStation 软件提取色谱峰面积及保留时间。绘制标准曲线，计算样品中中长链脂肪酸的含量。

2.3 转录组测序分析

按照Qingen（Qingen，DE）试剂盒[13]操作说明对样品中的总RNA进行提取，并去除总RNA中DNA片段的残留。分别使用NanoPhotometer分光光度仪、Qbuit 2.0 荧光计和Qubit RNA 检测试剂盒以及Agilent 2100和RNA Nano 6000试剂盒检测RNA纯度、RNA浓度以及RNA完整性。RNA检测合格后进行文库制备。使用Illumina HiSeq 2000 对RNA文库进行测序，获得原始测序数据。为了保证测序数据质量，对原始数据进行过滤，从而获得高质量数据（Clean data），用于后续生物信息分析。首先使用DESeq R（1.18.0）[14]进行基因表达量分析，筛选差异表达基因，然后通过GOseq R数据包[15]和KOBAS（2.0）[16]分别对差异表达基因进行GO功能注释和KEGG通路分析。

3 结果与分析

3.1 两个沙棘品种种子中脂肪酸组分差异分析

利用气相色谱分析，在2个品种沙棘的种子中共检测到27种脂肪酸（表1），其中，主要脂肪酸为C18:3N3(α-亚麻酸)、C18:2(亚油酸)、C16:0(棕榈酸)、C18:1(油酸)、C18:0(硬脂酸)。随着果实不断成熟，2个品种沙棘种子中，5种主要脂肪酸的含量均逐渐增加，其中，α-亚麻酸和亚油酸含量上升幅度较大。

从图1可以看出：XY与FN的5种主要脂肪酸的含量均在T2时期表现出显著差异。按照脂肪酸含量从大到小排序，在XY中，依次为α-亚麻酸、亚油酸、油酸、棕榈酸、硬脂酸，含量最高的脂肪酸为α-亚麻酸，亚油酸次之；而在FN中，脂肪酸从大到小排序依次为亚油酸、α-亚麻酸、棕榈酸、油酸、硬脂酸，亚油酸大于α-亚麻酸含量（图1）。

在T2时期，2个沙棘品种种子中α-亚麻酸与亚油酸的比值（α-亚麻酸/亚油酸）存在显著差异（P＜0.05）。XY中，T2时期3个样本的α-亚麻酸/亚油酸比值分别为1.21、1.17、1.16，而FN分别为0.92、0.75、0.92（表2）。

3.2 转录组数据分析探究沙棘种子α-亚麻酸的合成规律

以XY与FN种子的3个发育时期、每个发育时期3个生物学重复的18个样品为材料，通过RNAseq测序分析共产生140 G clean data，933 483 428条高质量序列(Clean reads)(Q20＞97%;Q30＞93%)，其中，81.5%的序列唯一比对到参考基因组上。对2个品种3个不同发育时期及相同时期不同品种间的表达基因进行差异分析，共鉴定出24 917个差异表达基因（DEGs）。从图2A样本DEGs的主成分分析(PCA)可以看出：2个沙棘品种各个时期生物学重复聚类效果良好，不同时期之间与不同品种之间数据离散效果良好。通过DEGs的分布图(图2B)可以看出：在T1-T3的发育过程中，在T2时期XY与FN之间的DEGs最多。

表1 XY与FN 2个沙棘品种种子在不同发育时期脂肪酸含量的动态变化Table 1 Dynamic changes of fatty acid composition in the seeds of XY and FN at different developmental stages μg·g-1

依据序列同源性将24 917个差异表达基因进行GO功能注释，2 605个基因注释为生物过程（Biological process），554个基因注释为细胞组成（Cellular component），1 354个基因注释为分子功能（Molecular function）。为了进一步了解基因的生物学功能和相互作用，使用KEGG数据库对基因进行通路富集分析。24 917个DEGs注释到122个KEGG通路，其中，有94个DEGs的功能富集于脂肪酸合成（Fatty acid biosynthesis）通路、脂肪酸代谢（Fatty acid metabolism）通路、α-亚麻酸代谢（α-Linolenicacid metabolism）通路和亚油酸代谢（Linoleicacid metabolism）通路。

图1 沙棘XY与FN种子中主要脂肪酸组分的含量变化Fig. 1 Distribution of main fatty acid components in XY and FN seeds of sea buckthorn

表2 T2时期XY与FN种子中的C18:3N3/C18:2Table 2 C18:3n3 / C18:2 in XY and FN seeds of sea buckthorn at T2

图2 主成分分析与差异表达基因上调和下调分布情况Fig. 2 PCA and up-regulated and down-regulated distribution of DEGs

图3 沙棘种子发育过程中与α-亚麻酸合成相关的基因表达模式Fig. 3 Gene expression profiles of Alpha linolenic acid biosynthetic genes during seed development of sea buckthorn

3.3 α-亚麻酸合成与代谢相关基因表达分析

T2时期，基因FAD2在2个沙棘品种中的表达量差异显著（图3），在XY中的表达量显著高于FN，是FN的3.83倍，为α-亚麻酸（C18:3N3）的合成提供充足底物。FAD2基因在XY和FN中表达量均为先上升后下降，在第2时期表达量急剧上升达到峰值，与XY和FN中的亚油酸（C18:2）含量在第二时期显著增加（图1）相一致。

基因FAD3和基因FAD7调控亚麻酸生成α-亚麻酸（图4），在FN中的整体表达水平远低于XY，与XY中α-亚麻酸含量高于FN（图1）的结果相一致。基因FAD3在FN种子中的表达呈下调趋势，在XY种子中的表达水平先急剧上升，在T2时期达到峰值，后在T3时期表达量下调；T1时期，基因FAD3在XY中的表达量是FN 中的2.02倍，T2时期基因FAD3在XY和FN中的表达差异显著，在XY中的表达量是FN中的13.63倍（图3）。基因FAD7在XY和FN中的表达趋势均为先上升后下降，T1和T2时期在XY中的表达量显著高于在FN中的表达量，T1时期在XY中的表达量是FN 中的2.09倍，T2时期在XY中的表达量是FN 中的1.72倍（图3）。

基因LOX调控α-亚麻酸氧化（图4），生成脂肪酸氢过氧化物，是调控α-亚麻酸转化为其他物质的第一步，基因LOX3.1在XY和FN种子的生长发育过程中表达趋势均为逐渐下降，在FN中的表达量高于XY，T1时期基因LOX3.1在FN中的表达量是XY中的3.58倍，T2时期基因LOX3.1在FN中的表达量是XY中的8.02倍（图3）。基因LOX3.2在FN中的表达量同样高于XY，T1时期在FN中的表达量是XY中的3.24倍，T2时期在FN中的表达量是XY中的7.12倍（图3）。基因LOX的高表达不利于α-亚麻酸的积累，与图1中所显示的XY中α-亚麻酸含量高于FN的结果相一致。

4 讨论

沙棘种子中富含不饱和脂肪酸，其中，α-亚麻酸含量一般较高。α-亚麻酸作为人体必需脂肪酸，具有多种有益的生理功能，因此，为了进一步提高沙棘种子中α-亚麻酸含量，培育沙棘新品种和良种，在分子水平上研究沙棘中α-亚麻酸的合成代谢规律至关重要。亚油酸是α-亚麻酸合成的底物，脱饱和生成亚麻酸[17-18]。本研究选取的2个沙棘品种中，α-亚麻酸/亚麻酸的比值存在显著差异，XY种子中α-亚麻酸是含量最高的脂肪酸，亚油酸含量次之，而在FN中正相反，含量最高的脂肪酸是亚油酸，α-亚麻酸含量次之。因此，基于这2个品种存在的差异挖掘沙棘种子中调控亚油酸向α-亚麻酸转化的关键基因以及抑制α-亚麻酸分解的关键基因，探究α-亚麻酸合成代谢规律。

FAD2催化油酸转化为亚油酸[19-21]，FAD2基因表达量下降使亚油酸合成受阻，进而影响α-亚麻酸的生成，而FAD2基因的高表达可以为α-亚麻酸的合成提供充足的底物。2个沙棘品种种子中的亚油酸含量在T2时期快速积累，与T2时期基因FAD2的表达水平急剧上升相一致。在XY和FN种子中，T1和T2时期之间的亚油酸含量差异显著。T3时期基因FAD2的表达量降低，亚油酸含量积累速度明显下降。

α-亚麻酸在FAD3和FAD7的催化下由亚油酸脱饱和产生[17-18]。FAD3与FAD7同属于ω-6 型脂肪酸去饱和酶，已有的研究表明，基因FAD3在植物种子α-亚麻酸的合成过程中起到关键作用[22-24]。实验表明，拟南芥的FAD3基因在大豆中异位表达可使大豆中α-亚麻酸含量增加，大豆的FAD3C基因在芝麻中特异性表达同样也可使芝麻中α-亚麻酸的含量显著提高[25]。此外，Wu等将麻风树的JcFAD3基因在拟南芥的种子中特异性表达使拟南芥种子中α-亚麻酸的含量提高了20.50%～24.94%；同时亚油酸的含量相比野生型降低了11.4%～23.5%[26]。在烟草中过表达拟南芥FAD7基因，同样使烟草中α-亚麻酸的含量升高且亚油酸含量下降[23]。

在T1和T2时期，XY中基因FAD3和基因FAD7的表达量远高于FN，尤其在T2时期，基因FAD3在XY和FN中的表达差异显著，在XY中的表达量是FN中的13.63倍，调控大量亚油酸脱饱和生成α-亚麻酸，因此，XY种子中α-亚麻酸的含量大于亚油酸的含量，而FN中亚油酸含量比α-亚麻酸高。这解释了为何基因FAD2在XY种子中的表达量高于FN，但亚油酸含量却是FN种子大于XY种子。

基因LOX是α-亚麻酸代谢过程中的关键基因，是调控α-亚麻酸转化为其他物质的第一步，调控α-亚麻酸氧化，生成脂肪酸氢过氧化物[27-29]。基因LOX3.1和基因LOX3.2在XY和FN发育的T1时期表达量处于3个时期的最大值，抑制α-亚麻酸的积累，协同基因FAD2、FAD3、FAD7在T1时期的低表达水平，导致T1时期α-亚麻酸含量处于低水平，T2时期基因LOX3.1和LOX3.2表达量下调，基因FAD2、FAD3、FAD7表达量急剧上升，因而α-亚麻酸含量在T2时期显著增长。同时，基因LOX3.1和LOX3.2在FN种子中的表达量高于XY种子，抑制FN种子中α-亚麻酸的积累，使FN种子中α-亚麻酸积累量低于XY。

沙棘种子中α-亚麻酸的高积累源于多个基因的协同调控作用，基因FAD2、FAD3、FAD7的高表达协同基因LOX3.1和LOX3.2的低表达使α-亚麻酸的高积累得以实现。

本研究在基因和代谢水平上研究沙棘中α-亚麻酸合成代谢规律，对进一步提高沙棘种子中α-亚麻酸含量、培育沙棘良种具有重要意义。

图4 与α-亚麻酸生物合成与代谢相关的途径Fig. 4 Pathway related to the biosynthesis and metabolism of α-linolenic acid

5 结论

通过对2个不同沙棘品种种子中中长链脂肪酸和转录组数据联合分析得出：沙棘种子中α-亚麻酸的高积累源于多个基因的协同调控作用。基因FAD2调控油酸去饱和生成亚油酸，其高表达为α-亚麻酸的合成提供了充足的底物。α-亚麻酸在基因FAD3和基因FAD7的调控下由亚油酸去饱和产生，基因FAD3和基因FAD7的高表达促进亚油酸向α-亚麻酸转化，使α-亚麻酸积累，同时使亚油酸含量下降。沙棘种子中基因LOX3.1和LOX3.2是α-亚麻酸代谢过程中的关键基因，其表达水平下降有利于种子中α-亚麻酸的积累。