基于静力称重法的微小容量光学检测系统标定

钟家栋, 孙 斌, 赵玉晓, 马鑫钰, 张竟月

(1. 中国计量大学, 浙江 杭州 310018; 2. 中国计量科学研究院, 北京 100029)

1 引 言

在蛋白质工程、基因测序、新药物研制、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)等各种类型的实验研究活动中,都需要对数以万计的微量级液体容量的酶类、添加剂、化合物等试剂进行在线分配转移操作[1,2]。另外,目前生命科学领域内使用的液体容量呈不断减小的趋势,在DNA分析、基因重组研究中,需要的液体容量都在μL级[3],微量液体容量的操作精度对实验效果的影响不断增大[4]。这要求对微量液体重复性精度的计量技术有非常精确的检测方法。因此,国际计量局技术咨询委员会(CCM.FF)已经将超微量容量校准列入国际关键对比(Key Comparison)计划,以此来到提高对微量液体精确计量的可靠性[5]。目前实验室常用的检测微量液体容量的方法为静力称重法,该法在1 μL容量的检测点重复性可达1.85%,精度达到2.18%[6～8]。 该检测系统对检测环境有着非常严格的要求,工作环境温度需要在1℃以内,工作台面需要防震防尘,设备仪器价格昂贵,因此该方法不适合在线检测。文献[9]提出了一种新型电容式非接触式传感器检测微量液体容量法,重复性达到0.13%,该法同样对环境及操作有严格要求,若有检测液残留在电极上,将引起电容介电常数的变化,严重影响精度[9]。

针对适用于微量液体容量的在线检测,在ISO 8655-7中提出了一种基于Lambert-Beer定律的光度参比法,该方法在紫外可见分光光度计的工作曲线内,对微量液体容量进行了检测,该法在1 μL检测点的精度为6.09%,重复性为1.31%。该法中的体积参照标准为实验室内配置的标准体积比,此体积比通过标准一级玻璃量器配制得到,但此参照标准存在参照点单一、线性度偏差、配制过程复杂等实际问题[10,11]。

经过对此法进行深入的研究以后,提出了一种建立该法中新的参照标准标定的方法。本文研究的方法通过实验室静力称重法代替标准液法重新标定参照标准,将参照标准由点扩展到线。通过实验的数据分析,新研究的标定方法提高了对微量液体容量的检测精度。

2 光学法原理

光度参比法依据Lambert-Beer定律,当一束光通过单一 、非散射的均匀吸光物质溶液时,溶液的吸光度A与摩尔吸光系数ε、溶液浓度c和光程b的乘积成正比,吸光度公式关系为:

(1)

式中I0和I1分别为入射光强度和出射光绝对光强度。

Lambert-Beer定律有2个重要的适用条件,首先要求吸光度A的值在0.2～0.8之间,在该范围外的吸光度变化线性度差,其次样品浓度需要控制在0.01 mol/L以下,浓度高时,吸光粒子间的平均距离减小,受粒子间电荷分布相互作用的影响,吸光粒子的摩尔吸收系数发生改变,导致偏离定律。

为了消去摩尔吸光系数和光程带来的系统误差,使吸光度仅与溶质浓度有关,实际检测时实验室选用在2种波长有吸收峰的溶液作为双波长吸收液,通过2者的比值同时约去参数摩尔吸光系数和光程。两种吸光液体的选择要求互在彼此的波长段内吸光度值为0,由式(1)可知约去摩尔吸光系数和光程后,吸光度仅与浓度成正比,而浓度又与溶质体积成正比,因此,可由吸光度的变化测量加入微量溶质的体积。

假设液体1在波长1处有吸收峰,液体2在波长2处有吸收峰。在实际检测之前先按照精确比例配制两种液体的混合液,使该混合液在波长1和波长2处同时有吸收值。将此混合液作为标准参照液,与待测液进行对比后计算待测液内的溶质体积。

2种液体按照一定比例混合后制成的标准液在波长1处、波长2处的吸光度和混合稀释比如式(2)、式(3)和式(4)所示。其中AS1、AS2为混合液在波长1和2处的吸光度；ε1、ε2为波长1和2处的摩尔吸光系数；c1、c2为混合前2种液体中吸光物质的浓度；R为混合稀释比例；V1,V2分别是2种液体的混合前体积。

AS1=ε1c1RL0

(2)

AS2=ε2c2(1-R)L0

(3)

(4)

将式(2)和式(3)相除得到双波长吸光度比值:

(5)

在实验室测得AS1,AS2,R以后其数值作为标准数据带到现场检测使用。在线检测时,首先在比色皿中加入一标准体积VD的液体2,并测量在液体2处有吸收峰的液体吸光度AD1,AD2,由于AD2的实际测量值会在分光光度计的不确定度范围内波动,所以将做AD1作为吸光度相对零点,AD2和相对零点做差后得:

AD2-AD1=ε2c2L′

(6)

式中L′为比色皿中的光程距离。

使用待检测移液器向比色皿中移入体积为VU(检测点)的液体1,同样可获得相对吸光度值:

(7)

整理式(2)、式(3)、式(4)、式(6)和式(7)得到:

(8)

光度参比法不受比色皿及环境因素差异的影响,适合现场检测环境下使用。该法的过程中最重要的一步是制备标准比例的标准液,在过去实现主要通过一级标准玻璃量器来实现其配比,以此实现高精度对低精度的检测。但该法存在些许不足,第一是该法配置的标准液只是一个配比单点,虽然理论上浓度与吸光度是完全线性的,但实际上不同次测量下存在一定波动,只用单点这个波动的误差会对结果造成全额误差;第二是该法对标准液的配置较为繁琐,且若使用液体的表面张力较大,则一级标准玻璃内残余液也相对较多,配置的标准液体积比也并非可靠。

3 拟合参值法标定原理

静力法通常只在实验室内使用,通过测液体的质量和密度来计算液体体积,精度可达到10-5级,高于移液器精度要求两个数量级,满足精度要求。光度参比法系统通过静力法标定可使在线测量结果更加接近实验室测量结果。

(9)

通过式(8)和式(9)可得:

(10)

式中AU,AD1,AD2由分光光度计测得;VU,VD由式(11)静力法通过质量与密度计算得到:

(11)

将各个检测点的K值为:

(12)

式中K1,K10,K20,K30,…,K100分别为对应μL级液体的配比点;n=1,2,…,100,对此直线进行总体最小二乘拟合,得:

K=a(VK)+m

(13)

式中a、m为最小二乘法待估参数,则误差方程为:

νK=[1VK][αm]-K

(14)

其中,νk=[νK1νK10νK20…νK100]T;K=[K1K10K20…K100]T;VK=[VK1VK10VK20…VK100]T。

在此约束条件下,其最小二乘解为:

(15)

则每一测量点的对应计算关系为:

Kν=a(ν)+m

(16)

在现场检测中,直接使用Kν,如式(17)所示。

(17)

此法与前法相比采用多点值计算,消除了不确定性误差,且操作相对于标准液配比法更加简易,但对实验室设备的要求较高,适合在实验室同时具备高精度天平和密度计的情况下使用。

4 实验与数据分析

光谱仪是本实验的一个重要的数据采集部分,其数据准确度直接影响计算结果。传统的光谱仪器,其庞大的体积,高昂的价格几乎将此类仪器设备限制在实验室中[12]。经典非对称型Czerny-Turner光学系统结构(图1)的发展使光谱仪走入小型化,使得光谱仪可以离开实验室,使用在在线检测系统中。图2为Czerny- Turner光学系统实物图,图3为Czerny-Turner光学光谱图。

图1 Czerny-Turner光学系统结构图Fig.1 Czerny-Turner Structure diagram of optical system

图2 Czerny-Turner光学系统实物图Fig.2 Czerny-Turner Optical system structure object chart

图3 Czerny-Turner光学光谱图Fig.3 Czerny-Turner Optical spectrogram

实验采用的光谱仪使用10 W的定功率钨光灯。传感器采用线阵型CCD TCD1304,其测量范围大、频率响应高,实时传输光电变换信号和自扫描速度快等优点而尤其适合光谱分析类精密测量领域,光谱仪的性能指标为波长分辨率0.5 nm,重复性0.5%,该型号的CCD可将吸光度变化控制在0.005以内,根据式(8)造成的系统误差为1%。

光学双波长法选用对520 nm和730 nm有吸收峰的2种液体作为原液和稀释液,所采用的溶液分别为Ponceau S水溶液和CuCl2·2H2O与EDTA、NaOH混合水溶液。具体浓度配置根据移液器检定点的大小变化而变化,最终需求是要将混合液的吸收度保持在0.2到0.8之间以满足Lambert-Beer定律的线性要求。

检测量程100 μL的移液器时,溶液配制步骤为:将0.476 g的Ponceau S加入水,配制成1 000 ml 溶液,作为原液;将1.12 g CuCl2·2H2O和3.74 g EDTA、13 mL的1 mol/L的NaOH溶液混合,加入水至1 000 mL,作为稀释液;首先需要对此2种液体的值进行计算。实验室采用的天平型号为MXP26PC,称重范围0～22 g,分辨率为0.001 mg。采用的密度计为Anton Paar 的DMA 5 000 U型管震荡密度计,测量分辨率为1×10-6g/cm3。

标准温度20 ℃时移液装置的实际容量的体积计算式为:

(18)

式中:m为被检移液装置所排出的蒸馏水表观质量;ρb为砝码密度;ρa为检定时实验室内的空气密度。

由表1可知实际情况下K值并非固定。使用平均K值作为拟合K值法的K,将2种方法的K值数据作为检测使用与静力称量法比较,如图4所示。

表1 K值实验数据Tab.1 K value experimental data

图4为100 μL点标准液法和拟合参值法对比实验数据,由图4可得出:在100 μL检测点,以静力称重法为理论结果,静力称重法的重复性为0.15%。标准液法的重复性为0.98%,拟合参值法重复性为0.53%;标准液法的测量偏差为0.902%,拟合参值法的测量偏差为0.310%。在JJG 646—2006中100 μL的重复性允差为1%,测量偏差允差为2%。拟合参值法在满足规程要求的情况下重复性和测量偏差都进一步提高。

图4 100 μL点标准液法和拟合参值法对比实验Fig.4 Contrast experiment of 100 μL point standard liquid method and fitting parameter method

同样,在10 μL点下对2种方法进行比较,如图5所示。由图5可得出:在10 μL检测点,以静力称重法为理论结果,静力称重法的重复性为1.60%。标准液法的重复性为1.83%,拟合参值法重复性为1.30%;标准液法的测量偏差为4.85%,拟合参值法的测量偏差为2.014%。在JJG 646—2006中10 μL的重复性允差为4%,测量偏差允差为8%。同样拟合参值法在满足规程要求的情况下重复性和测量偏差都进一步提高。

图5 10 μL点标准液法和拟合参值法对比实验Fig.5 Contrast experiment of 10 μL point standard liquid method and fitting parameter method

5 结 论

通过对实验数据分析得到以下结论:1)通过线阵CCD的光学系统与Ponceau S溶液的实验对该法进行实验验证,证明了该新标定方法可以代替原有的标准液法进行标定。2)将静力称重法与光学测量法结合后,采用新的标定方法,在100 μL测量点可将精确度由0.902%提高到0.310%;在10 μL检测点可将精度由4.85%提高到2.014%。3)新标定方法将检测点的参照标准由点拓展到线,实现了微量液体容量每一个检测点都有对应的参照标准,通过该原理提高了系统重复性,在100 μL点将重复性由0.98%提高到0.53%;在10 μL点将重复性由1.83%提高到1.30%。4)该方法适合在实验室有高精度天平和密度计的情况下,适用于0.1 μL到1mL的所以移液器检定量程,为有实验条件的实验室提供了一种全新的、更精准、更快捷的检测参考标定解决方案。