P21 抑制剂UC2288 诱导鼻咽癌放射抗拒细胞CNE-2R凋亡的研究

梁仁拔李欣晓朱小东

(1.广西医科大学附属肿瘤医院,南宁 530021；2.广西区域高发肿瘤早期防治重点实验室,南宁 530021；3.广西医科大学附属武鸣医院,南宁 530021)

鼻咽癌是发生于鼻咽部的恶性上皮肿瘤,常见于我国南方及东南亚地区,尤其在广东省高发,俗称“广东瘤”[1]。 放射治疗是鼻咽癌的主要治疗手段,大部分早期患者通过放射治疗能得到根治。 遗憾的是,临床上约有20%的鼻咽癌患者经过治疗后仍出现局部复发和远处转移[2-3],主要归因于鼻咽癌放射抗拒。 再程放疗毒副反应大,而且以铂类为基础的化疗反应率为40%～65%,预后差[3]。 因此,有必要探索更多的治疗策略,为鼻咽癌的治疗提供新的选择。

P21 是周期蛋白依赖性激酶抑制剂,参与DNA损伤反应[4]。 UC2288,分子式为C20H18ClF6N3O2,全称叫反-1-(4-氯-3-三氟甲基-苯)-3-[4-(5-三氟甲基-吡 啶-2-烷 氧 基)-环 己 基]-脲。 研 究 发 现,UC2288 是P21 的抑制剂,通过转录和转录后途径下调P21 的表达[5]。 UC2288 的结构与索拉非尼的结构相似[5]。 作为多种激酶抑制剂,索拉非尼能有效延长晚期肝癌、肾癌患者生存时间[6-7],在复发或者转移鼻咽癌患者中,也显示出一定的抗肿瘤作用[8-9]。 然而,与索拉非尼不同的是,UC2288 不抑制RAF 激 酶 或 者 VEGF 活 性[5]。 研 究 发 现,UC2288 对人结肠癌HCT116 细胞有一定的抑制作用[10],但其具体的作用机制及对其他肿瘤的影响尚不清楚,有必要进行更深入全面的研究。

本研究利用鼻咽癌放射抗拒细胞株CNE-2R[11-13],探讨UC2288 对CNE-2R 细胞增殖和凋亡的影响及其可能的作用机制,为鼻咽癌的治疗提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

CNE-2R 细胞由广西医科大学肿瘤医院放疗科构建。

1.2 主要试剂与仪器

UC2288 购自美国Abcam 公司；RPMI-1640 培养基,胎牛血清购自美国Gibco 公司；青链霉素,二甲基亚砜(DMSO)购自中国索莱宝公司；0.25%胰蛋白酶-EDTA 消化液购自中国碧云天公司；PBS 缓冲液购自中国中杉金桥公司；CCK-8 试剂盒购自日本同仁公司；Annexin V-APC/7-AAD 双染细胞凋亡检测试剂盒购自美国BD 公司；Hoechst 33342 染色液中国索莱宝公司；BCA 蛋白定量试剂盒中国碧云天公司；Western blot 所用抗体均购自美国Cell Signaling Technology 公司；增强型化学发光自显影试剂盒(enhanced chemiluminescence,ECL)购自中国百智生物公司；EVOS FL Auto 荧光显微镜购自美国Life technologies 公司；流式细胞仪购自美国BD公司。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养

鼻咽癌放射抗拒细胞CNE-2R 用RPMI-1640 完全培养液(含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 链霉素)置于37℃、5% CO2的饱和湿度培养箱中培养,待细胞贴壁生长至融合度达90%以上时,用胰酶消化传代。

1.3.2 药物配制

UC2288 用二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)配成5 mmol/L 的母液,置于-20℃冰箱储存。 临用时用完全培养液配制成不同浓度的工作液。

1.3.3 CCK-8 实验

取对数生长期的CNE-2R 细胞,以3500 个/孔、每孔100 μL 接种于96 孔板中培养,设空白组(不含细胞的培养液)、对照组(DMSO 组)及UC2288 处理组(2、4、6、8、12、16 μmol/L),每组5 个平行孔。24 h后,弃原培养液,按以上分组作用细胞24、48 h,每孔加入10 μL CCK-8 试剂,37℃避光孵育1 h 后,用酶标仪测450 nm 处吸光度(OD)值,计算细胞存活率。 存活率(%)= (OD处理组-OD空白组)/(OD对照组-OD空白组)×100%。

1.3.4 平板克隆形成实验

以300 个细胞/孔接种于6 孔板,置培养箱中培养24 h 后,用不同浓度的药物(0、2、4、6、8 μmol/L)作用细胞48 h。 更换新培养液继续培养12 d 后,PBS 缓慢冲洗2 次,4%多聚甲醛固定30 min,姬姆萨染色30 min,晾干后拍照,利用Image J 软件计算克隆数。

1.3.5 观察细胞形态

细胞接种于6 孔板,培养24 h 后,用不同浓度的药物(0(DMSO),4、6、8、12、16 μmol/L)作用细胞48 h。 于倒置显微镜观察细胞数量及形态变化。

1.3.6 流式细胞术检测细胞凋亡

堆料装置行走机构采用自行式驱动系统，对于场地不平的堆场建议采用履带式行走系统，行走机构在驾驶室通过操纵杆控制，操作自如。

取适量细胞接种于6 孔板中,待细胞贴壁后弃去旧培养基,加入不同浓度的药物(0、4、6、8、12 μmol/L)。 培养48 h 后,收集上清液,用不含EDTA 的胰蛋白酶消化并收集细胞,根据Annexin V-APC/7-AAD 试剂盒说明书操作,1 h 内上流式机检测。

1.3.7 Hoechst 33342 染色实验

取适量细胞接种于6 孔板中,待细胞贴壁后弃去旧培养基,加不同浓度的药物(0、4、8 μmol/L)。作用24 h 后,用PBS 缓慢冲洗2 次,每孔加入1 mL Hoechst 33342 染色液,37℃避光孵育30 min。 弃染色液,用PBS 洗涤2 次,于荧光显微镜观察细胞核的形态及染色的亮度。

1.3.8 蛋白免疫印迹

将细胞接种于25 cm2培养瓶中,培养至融合度为70%左右时,加不同浓度的药物(0、4、8 μmol/L)。 处理24 h 后,提取细胞蛋白,以BCA 法测蛋白浓度。 将蛋白样品等体积上样于10% SDS-PAGE电泳,冰中恒压湿转。 5%脱脂牛奶室温封闭1 h。TBST 洗膜,一抗Bcl-2(1 ∶1000)、Bax(1 ∶1000)、Survivin(1 ∶1000)、Cleaved-caspase 3(1 ∶1000)、Caspase 3(1 ∶1000)、γ-H2AX(1 ∶1000)、P21(1 ∶1000)、PARP(1 ∶1000)、GAPDH(1 ∶1000)4℃ 孵育过夜,TBST 洗膜3 次,每次10 min。 HRP 标记的山羊抗兔IgG 二抗(1 ∶1000)室温孵育1 h。 TBST 洗膜3 次,每次10 min。 ECL 化学发光试剂盒进行曝光显影。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 UC2288 降低CNE-2R 细胞的活力

UC2288 结构如图1A 所示。 CCK8 结果显示,UC2288 明显抑制CNE-2R 细胞的增殖,呈剂量依赖和时间依赖关系。 与对照组相比,当UC2288 浓度≥4 μmol/L 时,各组间存活率差异具有统计学意义(P＜0.05,图1B)

2.2 UC2288 抑制CNE-2R 细胞克隆形成

为进一步验证UC2288 对细胞增殖的影响,进行克隆形成实验。 结果表明,浓度≥4 μmol/L处理组的克隆形成数目明显减少(图2A),与对照组比较,差异具有统计学意义(P＜0.05,图2B)。 这显示UC2288 对细胞的长期增殖能力也有明显的抑制作用。

2.3 显微镜下观察细胞形态的变化

UC2288 处理CNE-2R 细胞48 h 后,直接在显微镜下观察,随着浓度的增加,细胞圆形萎缩或结构不完整, 体积变小, 脱落增多。 当浓度为16 μmol/L 时,细胞大部分脱落死亡(图3A)。Hoechst 染色后通过荧光显微镜观察,经药物处理后,细胞核皱缩,染色亮度增高,呈致密浓染或呈碎块状致密浓染(图3B),表明细胞染色质凝聚浓缩,发生凋亡。

图1 UC2288 对CNE-2R 细胞活力的影响Note.A, Structure of UC2288.B, Cell viability.Compared with control group, **P＜0.01, ***P＜0.001.Figure 1 The effects of UC2288 on cell viability of CNE-2R

2.4 流式细胞术检测细胞凋亡

鉴于UC2288 抑制细胞的增殖,且形态学观察发现细胞在药物的作用下发生死亡,本研究运用流式细胞术进一步检测UC2288 对细胞凋亡的影响。Annexin V-APC/7-AAD 双染实验表明,随着UC2288浓度的增高,细胞凋亡率显著增加(图4A),各处理组间差异具有统计学差异(P＜0.05,图4B)。

图2 UC2288 对CNE-2R 细胞克隆形成能力的影响Note.Compared with control group, **P＜0.01, ***P＜0.001.Figure 2 The Effects of UC2288 on clone formation ability of CNE-2R

图3 UC2288 对CNE-2R 细胞形态的影响Note.A, Cell morphology under light microscope.B, Hoechst 33342 staining.Figure 3 The effects of UC2288 on cell morphology of CNE-2R

2.5 UC2288 对凋亡相关蛋白的影响

蛋白免疫印迹结果显示,与对照组相比,随着UC2288 浓度的提高,促凋亡蛋白Bax、Cleavedcaspase 3、Caspase 3 表达增高,而抗凋亡蛋白Bcl-2、Survivin 表达下降。 DNA 双链断裂标志蛋白 γ-H2AX 表达升高,预示DNA 发生断裂损伤。 结果表明,UC2288 可能通过诱导DNA 双链断裂,引起细胞凋亡(图5)。

2.6 UC2288 对PARP 蛋白的影响

聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase,PARP]是DNA 修复酶。 如图6 所示,UC2288 作用细胞后,PARP 表达水平明显降低。 这表明,UC2288 可能通过抑制PARP 表达,诱导DNA损伤。

图4 UC2288 对CNE-2R 细胞凋亡的影响Note.Compared with control group, *P＜0.01, ***P＜0.001.Figure 4 The effects of UC2288 on cell apoptosis of CNE-2R

图5 UC2288 对CNE-2R 细胞凋亡相关蛋白表达的影响Note.Compared with control group, *P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001.Figure 5 The effects of UC2288 on expression of apoptosis-related proteins in CNE-2R

图6 UC2288 对CNE-2R 细胞PARP 蛋白表达的影响Note.Compared with control group, **P＜0.01, ***P＜0.001.Figure 6 The effects of UC2288 on expression of PARP in CNE-2R

3 讨论

鼻咽癌好发于东南亚地区。 每年新发病大约87000 例,70%患者是局部晚期[14]。 局部晚期鼻咽癌的标准治疗方案是放化疗。 经过治疗后,仍有10%患者出现残留或局部复发[15-16]。 再程放疗和手术可挽救局部治疗失败。 然而,再程放疗风险大,约33%患者发生5 级毒副反应[17]。 鼻咽位置较深,结构复杂,挽救性手术难度大,且40%以上的患者出现面部麻木、牙关紧闭、腭瘘等并发症[18]。 对于远处转移患者,采用以顺铂为基础的姑息化疗,反应率为40%～65%。 因此,需探索更多的治疗策略,为提高鼻咽癌疗效提供更多的选择。

本研究发现,UC2288 明显抑制CNE-2R 细胞的增殖,呈浓度-效应和时间-效应关系；Hoechst 33342 染色实验和流式细胞术结果提示UC2288 诱导CNE-2R 细胞凋亡,随着浓度的增加,凋亡率显著升高,且Western blot 中促凋亡蛋白Bax、Cleavedcaspase 3、Caspase 3 表达增高和抗凋亡蛋白Bcl-2、Survivin 表达下降,更加验证UC2288 的促凋亡作用。

聚腺苷二磷酸核糖聚合酶在DNA 单链断裂(single strand breaks,SSBs)修复中发挥重要的作用,主要通过碱基切除修复(base excision repair,BER)途径[19]。 PARP 被激活时,招募其他DNA 修复蛋白,参与DNA 损伤修复[20]。 抑制PARP 活性,可阻止DNA 单链断裂的修复,产生双链断裂,最终导致细胞死亡[21-22]。 因此,PARP 抑制剂已运用于临床,在卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌治疗中取得良好的疗效[23]。 有研究发现,P21 调节PARP活性,参与DNA 损伤修复[24]。 敲除P21,引起PARP 活化,减少DNA 损伤[25]。 本研究中,UC2288作用CNE-2R 细胞后,γ-H2AX 表达增加,PARP 表达下降,而P21 表达不呈剂量依赖性变化,这提示UC2288 可能不是通过P21 途径调控PARP,UC2288可能通过直接抑制PARP 的活性,从而引起DNA 双链断裂。 然而,这需要进一步实验的探索。

综上,本研究表明UC2288 可显著抑制CNE-2R细胞的增殖,诱导细胞凋亡,这可能与降低PARP 活性,引起DNA 双链断裂有关。 这为UC2288 进一步的研究提供理论基础,有可能为鼻咽癌的综合治疗提供更多的选择。