复合酶法制备玉米活性肽及其功能特性的研究

余平莲，程立君，李俊杰，熊汝琴，龚建康，马丽娇

（昭通学院化学化工学院，云南昭通 657000）

玉米蛋白粉是玉米淀粉生产中的副产物，大约含有60%的蛋白质，但由于其组成复杂、口感粗糙、水溶性非常差，严重限制了其在食品工业中的应用[1]。玉米活性肽是以玉米蛋白粉为原料，经过水解后得到的分子量小但是活性很高的短肽分子所组成的混合物[2]，相对于氨基酸或蛋白质来说，玉米活性肽更容易被人体吸收，而且在较大范围pH 值下完全溶于水，无浑浊和沉淀产生。除此之外，玉米活性肽的热稳定性好，且没有毒副作用，玉米活性肽是一种安全可靠的天然食品蛋白[3]。

玉米蛋白水解后得到的玉米活性肽大幅度提高了其溶解性，使起泡性增加，黏性降低，同时去除了不良风味等。而且，通过酶解玉米蛋白制备的玉米肽具有降血压[4-5]、促进酒精代谢[6-7]、防治肝性脑病、抗氧化[8]、抗疲劳[9]等生理功能。因此，玉米活性肽是一种安全稳定并且性能良好的生理活性肽。

玉米活性肽的制备方法很多，目前使用较多的是酶解法和微生物发酵法，酶解法具有作用专一性强、反应条件温和、无不良副反应、反应进程容易控制等特点[10]。酶的水解具有很高的选择性，其水解特性需要用严格的条件加以控制。因此，对酶的选择至关重要。选用碱性蛋白酶和胃蛋白酶2 种酶，以水解度为指标进行双酶分步水解，以先加胃蛋白酶后再加碱性蛋白酶为添加顺序，考查制备玉米肽的最佳条件，在酶解合适条件下，研究玉米肽的抗氧化功能，为玉米肽的制备和功能研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

玉米蛋白粉，邢台平安糖业有限公司提供；碱性蛋白酶（10 万U/g），四川省山野生物科技有限公司提供；胃蛋白酶（3 000 U/g），苏州科铭生物技术有限公司提供；DPPH 自由基，临邑县宏源化工商行提供；牛血清白蛋白，上海雪满生物科技有限公司提供；考马斯亮蓝G250，上海浩然生物技术有限公司提供。

752PC 型紫外可见分光光度计，天津冠泽科技有限公司产品；XMTD-204 型智能数显恒温水浴锅，天津市欧诺仪器仪表有限公司产品；FE20 型实验室pH 计，梅特勒—托利多仪器（上海） 有限公司产品；KQ2200DE 型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 酶解液的制备

取一定量的玉米蛋白粉，将其制成质量分数为6%的玉米蛋白溶液。用NaOH 溶液或HCl 溶液调节pH 值至酶作用的最适值，于恒温水浴锅中加热至酶作用的温度。将一定量酶用磷酸二氢钾缓冲液溶解活化后加入到蛋白液中，启动反应。反应每隔0.5 h调pH 值至起始值，达到预定时间后停止加热搅拌，酶解结束。

1.2.2 双酶水解法

基本操作同1.2.1，按胃蛋白酶作用条件进行水解，一定时间后，再调至碱性蛋白酶的作用条件，水解一定时间至酶解结束。

1.2.3 单因素试验

（1） 设定碱性蛋白酶酶解时间1.0 h，加酶量0.064 g，pH 值为9，按照40，50，60，70 ℃酶解温度进行水解；胃蛋白酶酶解时间1.0 h，加酶量0.004 g，pH 值为2，按照50，55，60，65 ℃酶解温度进行水解，考查温度对酶解效果的影响，选出较优水解温度。

（2） 设定碱性蛋白酶酶解温度50 ℃，加酶量0.064 g，pH 值为9，按照0.5，1.0，1.5，2.0 h 酶解时间进行水解；胃蛋白酶酶解温度60 ℃，加酶量0.004 g，pH 值为2，按照0.5，1.0，1.5，2.0 h 酶解时间进行水解，考查时间对酶解效果的影响，选出较优水解时间。

（3） 设定碱性蛋白酶酶解温度50 ℃，酶解时间1.0 h，pH 值为9，按照加酶量0.032，0.064，0.096，0.128 g 进行水解；胃蛋白酶酶解温度60 ℃，酶解时间1.0 h，pH 值为2，按照加酶量0.002，0.004，0.006，0.008 g 进行水解，考查加酶量对酶解效果的影响，选出较优加酶量。

（4） 设定碱性蛋白酶酶解温度50 ℃，酶解时间1.0 h，加酶量0.064 g，按照pH 值9，10，11，12进行水解；胃蛋白酶酶解温度60 ℃，酶解时间1.0 h，加酶量0.004 g，按照pH 值1.8，1.9，2.0，2.1进行水解，考查pH 值对酶解效果的影响，选出较优pH 值，结果以水解度为指标，进行单因素试验。

1.2.4 正交试验

在单因素试验的基础上，对酶解温度、酶解时间、加酶量及pH 值4 个因素选取3 个水平进行考查，以水解度为评价指标，采用L9（34）正交试验表进行正交试验优化。同样，以该因素表通过DPPH 自由基清除试验考查了玉米肽抗氧化能力。

碱性蛋白酶试验因素与水平设计见表1，胃蛋白酶试验因素与水平设计见表2。

表1 碱性蛋白酶试验因素与水平设计

表2 胃蛋白酶试验因素与水平设计

1.2.5 双酶水解试验

（1） 酶添加顺序对水解效果的影响试验。选取6%的底物质量分数按酶解单元操作进行试验，按不同顺序加酶。先加胃蛋白酶设定酶解条件为酶解时间1.5 h，加酶量0.006 g，pH 值为2，温度60 ℃，再加碱性蛋白酶，调节酶解条件为时间1.5 h，加酶量0.096 g，pH 值为10，温度50 ℃。

（2） 不同温度对水解效果的影响试验。碱性蛋白酶的最适温度为50 ℃，胃蛋白酶的最适温度为60 ℃，在底物浓度为6%的条件下，设置2 组试验，一组是先加胃蛋白酶后加碱性蛋白酶，按酶解单元操作对玉米蛋白粉进行双酶水解，胃蛋白酶设定酶解条件为酶解时间1.5 h，加酶量0.006 g，pH 值为2，温度50 ℃，再加碱性蛋白酶，调节酶解条件为时间1.5 h，加酶量0.096 g，pH 值为10，温度50 ℃。另一组先加胃蛋白酶后加碱性蛋白酶，按酶解单元操作对玉米蛋白粉进行双酶水解，胃蛋白酶设定酶解条件为酶解时间1.5 h，加酶量0.006 g，pH 值为2，温度60 ℃，再加碱性蛋白酶，调节酶解条件为时间1.5 h，加酶量0.096 g，pH 值为10，温度60 ℃。

（3） 不同时间对水解效果的影响试验。根据上述确定的条件，再分别确定胃蛋白酶和碱性蛋白酶的水解时间。在胃蛋白酶分别水解1.0，1.5，2.0 h时，分别加碱性蛋白酶再水解2 h，在碱性蛋白酶水解1.0，1.5，2.0 h 时分别测定水解度。

1.2.6 水解度（DH） 的测定

水解度（DH） 的测定采用pH-stat 滴定法[11]，pH-stat 法是依据恒定的pH 值条件下酶水解蛋白后形成的自由羧基、自由氨基或氨基酸残基数目不等，多肽在不同的pH 值下解离状态的不同而计算蛋白的水解度。水解开始时，调节体系的pH 值到某值，反应结束后再测定体系的pH 值，用一定质量分数的NaOH 溶液将体系的pH 值调回到反应开始时的值，通过记录碱液的消耗量，得出蛋白的水解度。按下式计算出水解度：

1.2.7 DPPH 自由基清除试验

采用对DPPH 自由基清除活性的测定获得玉米活性肽的抗氧化活性，具体操作为：称取0.049 g DPPH 自由基溶解在50 mL 无水乙醇中，然后取6 mL DPPH 自由基溶解液于试管中，加入8 mL 酶解液，在室温下放置30 min。立即倒入比色杯中，于波长517 nm 处进行实践扫描，测定吸光度，重复3 次。再用8 mL 蒸馏水做空白试验。

自由基清除活性计算如下：

1.3 数据统计分析

采用SPSS17.0 软件进行单因素方差分析（ANVO），显著水平为p<0.05；采用Origin 9.0 软件进行图形处理。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

不同温度对碱性蛋白酶和胃蛋白酶水解度的影响见图1。

图1 不同温度对碱性蛋白酶和胃蛋白酶水解度的影响

由图1 可知，随着温度的增加，碱性蛋白酶和胃蛋白酶水解度均呈现先上升后下降的趋势。碱性蛋白酶在50 ℃时水解度达到最大值，这是因为在酶的最适温度反应活性最强，超过酶的最适温度后，酶分子的空间结构由于温度的增加而发生改变，导致酶活性减弱或丧失，而影响催化效果，因而水解度急剧下降，选择40，50，60 ℃3 个水平参与正交试验。胃蛋白酶也是同样的原理，在60 ℃时水解度达到最大值，超过最适温度后，水解度下降，因此选择55，60，65 ℃参与正交试验。

不同时间对碱性蛋白酶和胃蛋白酶水解度的影响见图2。

图2 不同时间对碱性蛋白酶和胃蛋白酶水解度的影响

由图2 可知，随着时间的增加，碱性蛋白酶和胃蛋白酶的水解度均呈现上升的趋势。碱性蛋白酶在反应时间少于1 h 时，水解度显著增高，而反应时间超过1 h 后，水解度上升缓慢。这是因为刚开始酶与底物接触充分，快速发生反应，但是随着时间的增加，底物浓度降低，生成的产物也随之减少，反应速度也降低。胃蛋白酶的水解度随时间的延长而增高。2 组试验均选择1.0，1.5，2.0 h 参与正交试验。

不同加酶量对碱性蛋白酶和胃蛋白酶水解度的影响见图3。

图3 不同加酶量对碱性蛋白酶和胃蛋白酶水解度的影响

由图3 可知，随着加酶量的增加，碱性蛋白酶和胃蛋白酶水解度均呈现先快速上升后缓慢上升的趋势，这可能是因为受到底物浓度的限制。

pH 值对碱性蛋白酶和胃蛋白酶水解度的影响见图4。

图4 pH 值对碱性蛋白酶和胃蛋白酶水解度的影响

由图4 可看出，随着pH 值的增加，水解度均呈现先上升后下降的趋势，碱性蛋白酶在pH 值为10时水解度达到最大，胃蛋白酶在pH 值为2 时水解度达到最大。这是因为pH 值过高或过低都会改变酶的空间结构，甚至使酶失活；另外，pH 值还可能改变底物的解离状态，影响底物和酶的结合，进而影响水解的效果。因此，碱性蛋白酶和胃蛋白酶分别选取pH 值为9，10，11 和1.9，2.0，2.1 参与正交试验。

2.2 酶解条件的优化结果

通过正交试验，确定了碱性蛋白酶和胃蛋白酶水解的最适温度、时间、加酶量和pH 值。

正交试验结果见表3。

通过极差分析得出，碱性蛋白酶水解度各因素影响的主次关系为D>A>C>B，pH 值对水解度的影响最大，最佳配比为A3B2C3D3，即最适温度为60 ℃，最佳时间为1.5 h，最佳加酶量为0.128 g，最佳pH 值为11。此结果不在正交试验表中，经过验证试验，A3B2C3D3条件下进行水解得到水解液的水解度为13.63%，高于A3B2C1D3条件下水解度，因此选择A3B2C3D3作为最佳值。胃蛋白酶水解各因素影响的主次关系为C>D>A>B，加酶量对水解的影响最大，最佳配比为A2B2C3D1，即最佳温度为60 ℃，最佳时间为1.5 h，最佳加酶量为0.008 g，最佳pH 值为2.1，在此条件下进行水解得到水解液的水解度为22.12%。

表3 正交试验结果

2.3 酶添加顺序对碱性蛋白酶和胃蛋白酶水解效果的影响

试验结果显示，先加胃蛋白酶后加碱性蛋白酶的作用效果好于先加碱性蛋白酶后加胃蛋白酶。前者水解液的水解度为22.12%，而后者为13.63%。可能是因为胃蛋白酶水解能力较强，作用位点较多，水解一段时间之后，得到的可溶性短肽暴露出了较多的利于碱性蛋白酶的作用位点，水解效果较好。

2.4 不同温度对碱性蛋白酶和胃蛋白酶水解效果的影响

试验结果显示，50 ℃时水解度为28.74%，而60 ℃时，水解度为28.96%，这可能是因为胃蛋白酶起到水解的主导作用，所以确定双酶水解的温度为60 ℃。

2.5 不同反应时间对碱性蛋白酶和胃蛋白酶水解效果的影响

不同反应时间对碱性蛋白酶和胃蛋白酶水解度的影响见图5。

图5 不同反应时间对碱性蛋白酶和胃蛋白酶水解度的影响

由图5 可知，胃蛋白酶水解1.5 h 时加入碱性蛋白酶，水解度达到最高值。因此，确定胃蛋白酶的水解时间为1.5 h。因加入碱性蛋白酶后水解度持续上升，确定碱性蛋白酶的水解时间为2 h。双酶水解效果与单酶水解效果相比，水解度得到了明显的提高，且水解玉米蛋白粉的效果更彻底，肽的分子量越小，更加符合生理活性肽的要求。

2.6 玉米肽抗氧化性的测定结果

利用单酶和双酶水解后的玉米肽进行抗氧化试验，以自由基清除率为指标。

酶解后的玉米肽抗氧化最佳条件见表4。

表4 酶解后的玉米肽抗氧化最佳条件

由表4 可知，在2 种酶抗氧化的最佳条件下及在此最佳条件下的双酶水解中，碱性蛋白酶的自由基清除率最大为25.62%。

3 结论

采用碱性蛋白酶和胃蛋白酶对玉米蛋白粉进行酶解制备玉米活性肽，以水解度为指标，分别对2 种酶水解进行单因素试验，选取最佳反应条件，进行双酶分步试验（先加胃蛋白酶后加碱性蛋白酶），得到水解度与单酶试验结果进行比较，然后进行正交试验，得到最优条件，并测定DPPH 自由基清除率以及酸度得出玉米活性肽的功能。结果发现，通过正交试验得到2 种酶的最水解条件为碱性蛋白酶最适温度60 ℃，最佳时间1.5 h，最佳加酶量0.128 g，最佳pH 值11，在此条件下进行水解得到水解液的水解度为13.63%；胃蛋白酶最佳温度为60 ℃，最佳时间为1.5 h，最佳加酶量为0.008 g，最佳pH 值为2.1，在此条件下进行水解得到水解液的水解度为22.12%。

由于酶具有的单一性特点导致单一酶水解肽键位点有限，所以考虑使用双酶水解的方法来提高水解液的水解度。由于2 种酶最适pH 值相差较大，不能同时加入水解液中，所以采用先加一种酶反应一段时间后再调至另一种酶的作用条件，加入另一种酶反应相应时间的分布水解方式。确定了双酶水解的方法后再确定酶添加顺序、温度、时间等条件。最终结果为双酶水解液的水解度29.88%，明显高于单酶水解，可见双酶水解制备玉米肽的产量较高。

在最优条件下，采用碱性蛋白酶水解得到的玉米肽对DPPH 自由基清除率最大为25.62%，抗氧化性最好。