氧化还原介体对短程反硝化细菌亚硝氮积累影响研究

尹 鑫 ，何 川，魏立娥，赖发英，倪国荣，胡建民，周春火*

（1.江西农业大学 国土资源与环境学院/南昌市农业农田养分资源管理与农业面源污染防控重点试验室，江西 南昌 330045；2.江西省水利科学研究院，江西 南昌 330046）

【研究意义】随着人们生活水平的提高，水体氮素污染呈现越来越严重的趋势，基于硝化反硝化原理之上的传统生物脱氮工艺越来越难以满足日益严格的工程需要。厌氧氨氧化（anammox）工艺是利用anammox 细菌能够同时将氨氮和亚硝氮转化为氮气的新型生物脱氮工艺。该工艺成本低廉、环境友好，越来越引起了研究者的重视。厌氧氨氧化工艺成功启动和运行需要消耗大量的亚硝酸盐[1-2]。因此如何持续稳定的获得亚硝酸盐对于厌氧氨氧化工艺研发和应用具有重要的意义。【前人研究进展】前人研究者大多采用前置短程硝化工艺将硝化反应控制在亚硝氮的阶段大量积累亚硝酸盐。如Zeng 等[3-4]研究发现，将硝化反应溶解氧控制在0.3～0.7 mg/L可以有效抑制亚硝酸盐氧化细菌的活性从而实现大量亚硝氮的积累。但是，硝化工艺通常都是采用连续曝气的方式，该过程容易导致溶解氧持续升高，亚硝酸盐的氧化菌的活性很快得以恢复。不仅如此，低的溶解氧浓度还会极大的降低短程硝化细菌的活性，最终影响短程硝化-厌氧氨氧化的脱氮效率[4]。因此，前人研究表明通过控制亚硝酸盐氧化细菌的活性实现短程硝化使得亚硝氮积累比较困难。近年来，通过短程反硝化实现亚硝氮的积累供给厌氧氨氧化反应，也引起了研究者的兴趣。Cao和Du等[5-6]通过过程控制利用短程反硝化细菌将80%的硝酸盐氮控制在了亚硝氮的阶段。但是现有的研究报道短程反硝化的硝酸盐氮转化率在1.0 kg/m3/d以下。因此，如何更有效的实现短程反硝化是一个值得研究的问题。【本研究切入点】近年来，研究者发现氧化还原介体能够极大的加快厌氧微生物的活性。NQS 对硫自养反硝化细菌的活性具有较大的促进作用。郭建博等[7]通过海藻酸钠固定化蒽醌附近了反硝化细菌的活性，并且证明不同的蒽醌对反硝化细菌的活性的影响具有极大的不同。Kelson 等[8]研究发现，氧化还原介体的投加会对硝酸盐还原酶和亚硝酸盐还原酶产生不一样的影响。笔者前期的研究[9]也证明，不同的氧化还原介体确实会对反硝化细菌的活性产生不同的影响，并且2-羟基-1,4 萘醌的投加几乎导致反硝化过程没有亚硝氮的积累[9]。显然，通过投加氧化还原介体是有可能导致反硝化的中间过程（即硝氮转化为亚硝酸盐和亚硝酸盐转化为氮气）发生不对称的变化的，但是前期研究并没有发现哪一类氧化还原介体会导致亚硝酸盐的明显积累。【拟解决的关键问题】本研究拟通过氧化还原介体的投加实现更快的短程反硝化，并且优化反应条件进一步增加亚硝氮的积累，为厌氧氨氧化工艺应用提供一种新的亚硝氮供给方式，为厌氧氨氧化工艺与短程反硝化工艺相结合奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 菌种来源和废水配制

厌氧污泥来自于江西省南昌市青山湖污水处理厂。以葡萄糖为唯一碳源，KNO3为唯一氮源，保持碳氮比为4∶1，将该厌氧污泥逐渐培养为反硝化污泥并稳定运行了半年。反硝化反应器的进水按照Yin等[9]描述的方法配制。

1.2 分析方法

水质中亚硝氮和硝氮的测定采用离子色谱法(ICS-900，DIONEX，USA）。总悬浮固体和挥发性悬浮固体采用国标法测定。pH 值和溶解氧分别通过pH 计（PHS-25，Leici Company，China）和溶解氧仪测定(YSI，Model 55，USA）。此外，菌种鉴定委托上海生工研发部代为鉴定，分析方法与Yin 等[9]报道的一致。

1.3 反硝化关键酶活性的测定

从自行培养的实验室规模的反硝化反应器中取出2 g湿污泥进行粗酶提取，粗酶提取方法与Qiao等[10]报道的一致。以牛血清蛋白作为标准，按照Bradford等[11]描述的方法测定粗酶的蛋白质含量。反硝化细菌的关键酶活性根据Kataoka 和Zhao 等[12-13]描述的方法测定。以硝酸盐氮和亚硝酸盐氮的消耗来表征硝酸盐还原酶和亚硝酸盐还原酶的活性，其单位为1µmol of nitrate or nitrite/min。试验中硝氮和亚硝氮采用离子色谱法测定。

1.4 序批式试验

首先，从试验室反硝化反应器中取出部分湿污泥，用蒸馏水冲洗3 次并离心（10 000 rad/s，4 ℃），弃掉上清液。其次，将洗干净的污泥各取出0.5 g湿污泥放入120 mL血清瓶；再次，向血清瓶中加入配置好的反硝化人工废水100 mL；最后，曝氮气5 min 后，将血清瓶放入水浴摇床。水浴摇床的温度设置为35 ℃，营养液的起始硝酸盐浓度统一配置为100 mg/L，初始pH为7.5。

2 结果与讨论

2.1 不同浓度2-甲基-1,4萘醌（ME）对短程反硝化亚硝氮积累影响

首先，考察了ME 浓度梯度为0，25，50，75，100µmol/L 对短程反硝化细菌的影响（C/N=4）。如图1a所示，随着ME 浓度的提高，短程反硝化细菌去除硝酸盐的速率呈现先上升后下降的趋势。4 h 内ME 投加量为75µmol/L的试验组硝酸盐已经被完全去除，而对照组硝酸盐剩余24.28 mg/L。当ME投加量继续增加至100 µmol/L 时，硝酸盐消耗速率反而呈现明显下降的趋势，此时反应4 h 之后硝酸盐浓度剩下18.56 mg/L，这可能与氧化还原介体的毒性效应有关。如图1b 所示，亚硝氮的积累量与硝酸盐的降解率呈现完全不同的趋势。试验结果显示，当ME投加量分别为0，25，50，75µmol/L时，亚硝氮的最大积累量并无明显的变化，分别为20.49，18.47，19.84，19.45 mg/L。当ME 投加量增加至100µmol/L 时，亚硝氮的最大积累量反而下降到16.51 mg/L，这可能与ME 的高剂量毒性导致硝酸盐的降解效率有关系。试验结果表明，合适浓度的ME 投加虽然会明显增强反硝化细菌的脱氮效率，但并不能明显加快亚硝酸盐的积累效率。而ME 的高剂量投加（100µmol/L）反而会降低反硝化细菌的脱氮效率导致亚硝酸盐的积累效率下降，这可能与氧化还原介体的高剂量细胞毒性有一定的关系[7]。

图1 比较不同浓度ME对短程反硝化亚硝氮的积累量Fig.1 Comparison of nitrite accumulation with different dose of ME addition by partial denitrification

2.2 不同浓度蒽醌（AQ）对短程反硝化亚硝氮积累影响

其次，考察了投加量为0，25，50，75，100µmol/L 时，蒽醌对短程反硝化细菌的影响（C/N=4）。与ME一样，随着蒽醌浓度的升高，反硝化细菌对硝酸盐氮的去除效率同样呈现先上升后下降的趋势，如图2a所示。当试验进行到第4小时的时候，5组试验的硝酸盐浓度分别为24.28，10.66，7.64，0，15.64 mg/L。显然，合适浓度的蒽醌添加能够明显加快反硝化细菌对硝酸盐的降解，75µmol/L 的蒽醌投加具有最高的硝酸盐降解效率。但是，AQ 与ME 呈现完全不同的亚硝酸盐氮积累效应。如图2b所示，当AQ 投加量为25，50，75 µmol/L 时，短程反硝化亚硝酸盐的积累量最高达到了28.47，31.54，35.75 mg/L，相比空白（20.49 mg/L）提高了38.9%、53.93%和74.8%。显然，合适浓度的AQ添加，明显加快了亚硝酸盐的积累效率。但是，随着AQ的投加量升高至75µmol/L时，虽然其亚硝酸盐量依然达到了25.46 mg/L，高于空白对照但是低于75µmol/L。显然，高剂量的AQ依然表现出对反硝化细菌明显的细胞毒性。

图2 比较不同浓度AQ对短程反硝化亚硝氮积累量Fig.2 Comparison of nitrite accumulation with different dose of AQ addition by partial dentitrification

2.3 不同浓度1,氯-蒽醌（1-AQ）对短程反硝化亚硝氮积累影响

再次，考察了不同浓度1-AQ投加对短程反硝化细菌脱氮效率的影响，试验设置的1-AQ投加浓度梯度同样是0，25，50，75，100µmol/L（C/N=4）。试验结果显示，相同浓度的1-AQ 投加呈现比ME 和AQ 更快的反硝化过程硝酸盐氮去除效率。经过4 h 反应，投加了氧化还原介体1-AQ 的4 组试验均几乎实现了硝酸盐氮的完全去除(图3a）。相对而言，75µmol/L 1-AQ 的投加呈现更快的硝酸盐去除效率。并且，当试验进行到第4 小时时，1-AQ 投加量为75µmol/L 的亚硝酸盐积累量达到了惊人的42.18 mg/L，是对照亚硝盐积累量的2.06倍，相比同样浓度的AQ添加也提高了18.0%，如图3b所示。试验结果表明，投加不同的氧化还原介体，短程反硝化细菌会表现出不同的亚硝酸盐积累效应。对于以实现更高的亚硝酸盐积累为目的的短程反硝化而言，1-AQ的投加是更好的选择。

图3 比较不同浓度1-AQ对短程反硝化亚硝氮积累量Fig.3 Comparison of nitrite accumulation with different dose of AQ addition by partial dennitrification

2.4 碳氮比对投加介体短程反硝化亚硝氮积累的影响

苑宏英等[14]研究表明，碳氮比是影响投加氧化还原介体反硝化脱氮效率的关键因素之一。因此，试验还考察了碳氮比分别为0.5、1、2和4时对投加75µmol/L 1-AQ短程反硝化亚硝氮积累的影响。如图4a所示，当碳氮比为0.5～4 时，经过5 h 的反应，反硝化细菌几乎都能实现硝酸盐的完全去除。随着C/N 的升高，反硝化去除硝酸盐氮呈现明显更快的趋势。当C/N 达到4 时，经过2 h 的反应，反硝化细菌就能完全去除水中的硝酸盐氮。但是，与硝酸盐去除效率不同，75µmol/L 1-AQ 短程反硝化亚硝氮的最大积累量随着C/N 的升高呈现先上升后下降的趋势。当C/N 为2的时候，序批式试验中反硝化过程亚硝氮积累量最大达到了52.98 mg/L，相比碳氮比分别为0.5 和1 时的亚硝氮积累量分别提高了1.34 倍和47.9%，相比碳氮比为4 的积累量也高了25.6%。显然，碳氮比对于投加介体短程反硝化亚硝氮积累也有很大的影响，适合的C/N才能实现短程反硝化亚硝氮积累的最大化。

图4 比较不同C/N对投加介体短程反硝化亚硝氮积累量Fig.4 Comparison of nitrite accumulation with different C/N ratio by partial dentitrification with RMs addition

2.5 不同介体影响短程反硝化亚硝氮积累的机理研究

图5 比较投加不同氧化还原介体时反硝化关键酶NR和NIR的活性Fig.5 Comparison of crude NR and NIR enzymes activities with different RMs addition

前人研究[16]发现，反硝化细菌中存在两种催化反硝化过程的关键酶NR 和NIR，这2 种酶分别控制反硝化过程NO3-N 转化为NO2-N 和NO2-N 进一步转化的关键步骤。Yin 等[9]研究表明，这两种关键酶的酶促反应速率的不均衡可能是导致亚硝氮是否积累的关键因素。试验分别考察了ME、AQ 和1-AQ 对反硝化细菌关键酶NR 和NIR 的影响。试验结果表明，合适浓度的3 种氧化还原介体均会加速NR 和NIR 的关键酶酶促反应速率，但加速效果略有不同。以ME 为例，促进效率最高的75 µmol/L ME 投加导致反硝化细菌NR 的酶促反应速率相比对照提高了66.08%，但是与此同时75µmol/L ME 也导致NIR 的活性提高了76.90%，如图5a 所示。通过与亚硝酸盐的积累量对比可以推测，等比例同时促进反硝化细菌NR 和NIR 活性或者是促进NIR 效果更好的的氧化还原介体不能增加短程反硝化亚硝氮的积累量。但是，75µmol/L AQ 和1-AQ 分别导致反硝化细菌NR 的活性提高了64.53%和69.20%，但是仅仅提高了53.94%和36.74%的NIR 活性，如图5b所示。显然，AQ 和1-AQ 能够导致反硝化细菌亚硝氮快速积累的原因在于这两种氧化还原介体促进NR的酶促反应速率明显高于NIR。

2.6 菌群分子生物学分析

对试验所用的微生物菌群进行16S rDNA 分析，将得到的序列与NCBI 基因文库中进行序列比对并进行群落聚类及相关分析（OTU），利用OTU 分类建立系统发育树。从图6 可以看出，实验室反应器中培养的反硝化污泥含有的微生物种类较多，成功获取的28 个基因中总共包含11 个序列。其中Yersinia frederiksenii，Thauera，Hydrogenophaga，Trichococcus，Klebsiella和Dechloromonas等6 种微生物是被认为具有短程反硝化能力和的菌群，该类细菌占总菌群的75%[6,15]。菌种分子生物学分析结果表明短程反硝化细菌的存在是导致反硝化过程亚硝酸盐积累的关键因素之一。

图6 试验菌群的OTU分析Fig.6 OTU analyses of experimental flora

3 结论

通过序批式试验考察了不同氧化还原介体对短程反硝化亚硝酸盐积累量的影响。研究结果表明：（1）当碳氮比为2，投加75µmol/L 1-AQ 能将短程反硝化亚硝氮的最大积累量增加1.06 倍；（2）碳氮比的改变会明显影响介体投加短程反硝化亚硝氮积累量；（3）当氧化还原介体对NR 的促进效果明显高于NIR 时才能增加短程反硝化亚硝酸氮的积累；（4）试验结果表明短程反硝化细菌的存在是导致反硝化过程亚硝酸盐积累的关键因素。

实现短程反硝化亚硝酸盐超量积累的目的主要在于为厌氧氨氧化细菌反应提供一种新的底物来源。因此，氧化还原介体影响下的短程反硝化细菌是否能为厌氧氨氧化反应提供稳定的亚硝酸盐来源值得深入研究。而且，前人研究表明，大部分氧化还原介体对厌氧氨氧化细菌存在一定的抑制作用[10]，在短程反硝化-厌氧氨氧化耦合体系中，如何削弱氧化还原介体的毒性也值得进一步探索。