连作对广藿香扦插苗土壤微生物及酶活性的影响

洪 彪，李 明，黄结雯，李敬辉，蔡 淼

（广东药科大学 中药学院/国家中医药管理局岭南药材生产与开发重点研究室，广东 广州 510006）

【研究意义】广藿香Pogostemoncablin（blanco）benth.为唇形科刺蕊草属植物，常用其地上干燥部分入药，开胃止呕，发表解暑[1]，具有抗菌抗病毒和对肠道调节的功能[2]。在生产中发现，广藿香存在连作障碍，不仅严重影响产量，还对其品质有较大影响[3]。【前人研究进展】目前关于连作障碍[4]的原因主要归纳为以下3个方面：土壤生物学环境破坏、化感自毒作用和土壤理化性质恶化[5-8]。在土壤中进行的各种生理生化活动中，土壤酶活性占有重要地位[9-12]。吴凤芝、李忠[14-15]研究表明随着连作年限的增加，土壤中的脲酶、过氧化氢酶和转化酶的活性显著地降低，而多酚氧化酶的活性显著升高。土壤细菌、真菌及放线菌种群的数量对于植物的生长、发育起到重要的影响。在对花生[15]、烤烟[17]连作的研究中发现，连作使根际土壤中的微生物种群比例失调，细菌和放线菌数量明显降低，真菌数量升高，且土壤由细菌型向着真菌型转变，从而导致植株易染病或死亡。【本研究切入点】一些研究表明，连作导致根附近的代谢产物及植物组织腐解物对后茬作物产生的化感自毒作用，以及对土壤微生物的种群分布产生的间接影响，导致后茬生长的不利影响。本实验室的前期研究[18-21]表明，广藿香不同部位及根际土壤水浸液对其不定根的形成及其生长产生化感作用。【拟解决的关键问题】为了进一步研究连作对栽培广藿香土壤的影响，将采用盆栽试验，研究连作对广藿香幼苗土壤酶活性和微生物区系的变化，探讨广藿香连作障碍与土壤酶活性和微生物变化的关系，旨为广藿香连作障碍及缓解连作障碍提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试广藿香插穗、枯叶、重茬土和未种植过广藿香的对照土均取自广东药科大学大学城药圃（23°20′N，113°30′E，年降水量：1 623～1 900 mm，温度：24～32 ℃）有机质含量43.09 g/kg、碱解氮含量162.49 mg/kg、有效磷含量47.80 mg/kg、速效钾含量949.14 mg/kg、pH=7。

1.2 试验方法

1.2.1 广藿香枯叶腐解液的制备 参考吴燕燕[22]的方法制备不同质量浓度广藿香枯叶腐解液：取广藿香枯叶，置于室内自然风干，剪成2～3 cm 的小段后用粉碎机粉碎，过100 目筛收集粉末。分别称取上述粉末适量，按1∶1∶10（枯叶∶土壤∶水）加入无菌水搅拌均匀，置于35 ℃恒温恒湿箱中腐解30 d，先用脱脂棉滤除残渣，再抽滤2 次，滤液为供试母液，质量浓度记为0.1 g/mL，置于冰箱4 ℃待用。取以上母液适量，经稀释得到质量浓度为0.01，0.03，0.05，0.07 g/mL腐解液。

1.2.2 广藿香扦插苗的培育 将已经扦插生根的2 周、8 周龄的广藿香扦插苗移栽到土砂比例为9∶1的不同基质中。试验共设6 个处理（对照土组、重茬土组、不同质量浓度枯叶腐解液组），每个处理重复3次，每组6株。每天定期定量浇灌10 mL腐解液或水。进行室内常温培养。培养至20，40，60 d，每个处理组随机取样3盆检测指标。

1.2.3 土壤微生物数量测定 参考刘素慧[23]的试验方法，在超净工作台中，分别称取土样10 g，加入90 mL无菌水中，即为10-1稀释的土壤悬浮液，置摇床上振动30 min，使土壤颗粒均匀分散，用蒸馏水稀释到相应倍数。真菌为10-2和10-3，放线菌为10-4，细菌为10-5。每个质量浓度接种3 个重复，倒置于28 ℃恒温培养箱内培养。第3天进行真菌计数，第5天进行细菌计数，第10天进行放线菌计数。计数完毕后计算每克干土中的微生物数量。

细菌培养基：牛肉膏蛋白胨培养基，成分：牛肉膏0.5 g，蛋白胨1 g，氯化钠0.5 g，琼脂2 g，蒸馏水100 mL，pH 7.0～7.2。

真菌培养基：马丁氏培养基，成分：磷酸氢二钾1 g，七水硫酸镁0.5 g，蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，琼脂18 g，水1 000 mL。每升培养基加1%孟加拉红水溶液3.3 mL。临用时，当培养基冷却到40 ℃左右时，每培养基中加链霉素水溶液3.3 mL。

放线菌培养基：改良高氏一号培养基，成分：可溶性淀粉20 g，氯化钠0.5 g，销酸钾1 g，磷酸氧二钾0.5 g，七水硫酸镁0.5 g，七水硫酸铁0.01 g，琼脂18 g，水1 000 mL，pH7.2～7.4。临用时在已融化的高氏号培养基中加入重铬酸钾溶液，以抑制细菌和霉菌生长。每30 mL培养基中加3%重铬酸钾1 mL（100 mg/kg）。

1.2.4 土壤酶活性测定 参考关松荫[24]、李振高[25]的试验方法。土壤脲酶活性的测定采用靛酚蓝比色法，酶活性以24 h后1 g干土中NH3-N的质量表示，单位为mg/g；土壤酸性磷酸酶活性的测定采用磷酸苯二钠比色法，酶活性以1 g干土的酚毫克数表示，单位为mg/g；土壤蔗糖酶活性的测定采用3，5-二硝基水杨酸比色法，酶活性以24 h后1 g干土中葡萄糖的质量表示，单位为mg/g；土壤多酚氧化酶活性测定采用邻苯三酚比色法，酶活性以2 h后1 g干土生成的紫色没食子素毫克数表示，单位为mg/g；土壤过氧化氢酶活性测定采用高锰酸钾滴定法，酶活性以20 min后每克干土消耗的高锰酸钾溶液的毫升数表示，单位mL/g。

1.3 数据分析

使用Excel 2013 和SPSS 20.0 进行数据处理。样品间差异的显著性检验（a=0.05）采用单因素方差分析（on-way ANOVA），并使用Duncan新复极差法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 广藿香重茬土壤、枯叶腐解液对根际土壤微生物数量的影响

本试验结果表明，不同培养基质下培养的2周龄苗、8周龄苗根际土壤菌群数量均有所差异（表1、2）。2周龄苗、8周龄苗移栽到广藿香重茬土壤上，在不同培育时期内，土壤细菌和放线菌数量较对照土显著减少（P＜0.05），真菌数量显著增加（P＜0.05），在培育60 d时，2周龄苗根际土壤细菌和放线菌数量分别较对照土减少了34.39%、37.05%，根际土壤真菌数量分别较对照土增加了80.55%。8周龄苗根际土壤细菌和放线菌数量分别较对照土减少了73.10%、39.76%，真菌数量分别较对照土增加了56.91%。

表1 广藿香重茬土壤、枯叶腐解液对2周龄苗根际土壤微生物种群数量的影响Tab.1 Effects of continuous cropping soil and decomposed liquid of leaves on soil microbialpopulation of P.cablin of 2 weeks in its stem cuttings

表2 广藿香重茬土壤、枯叶腐解液对8周龄苗根际土壤微生物种群数量的影响Tab.2 Effects of continuous cropping soil and decomposed liquid of leaves on soil microbial population of P.cablin of 8 weeks in its stem cuttings

在广藿香枯叶腐解液的培养基质中，在培育60 d 时，2 周龄苗、8 周龄苗根际土壤细菌和放线菌数量随添加处理枯叶腐解液质量浓度的升高呈先升后降的变化，真菌数量随添加处理液质量浓度的升高呈升高的变化。重茬土壤和相同质量浓度枯叶腐解液对2 周龄苗的根际土壤真菌数量影响比8 周龄苗根际土壤真菌数量大。且2 种苗龄的扦插苗根际土壤细菌和放线菌数量均随培育时间的延长呈先增加后减少的趋势，真菌数量呈不断增长的趋势。

2.2 广藿香重茬土壤、枯叶腐解液对扦插苗根际土壤酶活性的影响

2.2.1 广藿香重茬土壤、枯叶腐解液对扦插苗根际土壤脲酶活性的影响 本试验结果表明，如图1、2 所示，2 周、8 周龄苗广藿香扦插苗培育在不同处理基质中，在培养期间，其脲酶活性较对照土均呈降低变化，较重茬土均呈升高变化（P＜0.05），且2种苗龄的扦插苗根际土壤脲酶活性均随培育时间的延长呈先升后降的趋势。2 周龄幼苗在不同处理组中脲酶活性在0～60 d 内出现先升后降的趋势，在40 d 达到高峰。而8周龄苗在培育0～40 d内，土壤脲酶活性与对照土和重茬土相比显著降低（P＜0.05），重茬土的脲酶活性较对照的显著降低（P＜0.05）。比较而言，重茬土壤和枯叶腐解液对2 周龄苗的根际土壤脲酶活性影响比8周龄苗大。

图1 不同质量浓度的枯叶腐解液和重茬土壤对2周龄苗根际土壤脲酶活性的影响Fig.1 Effects of continuous cropping soil and leaves decay solution of different concentrations on the activity of urease in the rhizosphere soil of 2 weeks P.cablin in its stem cuttings

图2 不同质量浓度的枯叶腐解液和重茬土壤对8周龄苗根际土壤脲酶活性的影响Fig.2 Effects of continuous cropping soil and leaves decay solution of different concentrations on the activity of urease in the rhizosphere soil of 8 weeks P.cablin in its stem cuttings

2.2.2 广藿香重茬土壤、枯叶腐解液对扦插苗根际土壤酸性磷酸酶活性的影响 本试验结果表明，如图3、4所示，2周、8周龄苗广藿香幼苗在0～60 d培养期间，其0.01，0.03，0.05 g/mL枯叶腐解液处理组酸性磷酸酶活性较重茬土均呈升高变化，较对照土呈降低变化（P＜0.05）。且土酸性磷酸壤酶活性均随培育时间的延长呈先升后降的趋势，而0.07 g/mL枯叶腐解液处理组在40～60 d较重茬土显著降低（P＜0.05），重茬土的酸性磷酸酶活性较对照土的呈降低变化。比较而言，重茬土壤和相同质量浓度枯叶腐解液对2周龄苗的根际土壤酸性磷酸酶活性影响比8周龄苗大。

图3 不同质量浓度的枯叶腐解液和重茬土壤对2周龄苗根际土壤酸性磷酸酶活性的影响Fig.3 Effects of continuous cropping soil and leaves decay solution of different concentrations on the activity of acid phosphatase in the rhizosphere soil of 2 weeks P.cablinin its stem cuttings

图4 不同质量浓度的枯叶腐解液和重茬土壤对8周龄苗根际土壤酸性磷酸酶活性的影响Fig.4 Effects of continuous cropping soil and leaves decay solution of different concentrations on the activity of acid phosphatase in the rhizosphere soil of 8 weeks P.cablin in its stem cutting

2.2.3 广藿香重茬土壤、枯叶腐解液对扦插苗根际土壤蔗糖酶活性的影响 本试验结果表明，如图5、6所示，2 周、8 周龄苗广藿香扦插苗在0～60 d 培养期间，其0.01，0.03，0.05 g/mL 枯叶腐解液处理组蔗糖酶活性较重茬土均呈升高变化，较对照土呈降低变化（P＜0.05）。且土壤蔗糖酶活性均随培育时间的延长呈先升后降的趋势，而0.07 g/mL枯叶腐解液处理组在40～60 d较重茬土显著降低（P＜0.05），重茬土的蔗糖酶活性较对照土的均呈降低变化。比较而言，重茬土壤和相同质量浓度枯叶腐解液对2周龄苗的根际土壤蔗糖酶活性影响比8周龄苗大。

2.2.4 广藿香重茬土壤、枯叶腐解液对扦插苗根际土壤多酚氧化酶活性的影响 本试验结果表明，如图7、8所示，2周、8周龄苗广藿香扦插苗在0～60 d培养期间，其0.01，0.03，0.05 g/mL枯叶腐解液处理组多酚氧化酶活性较对照土的呈降低变化，较重茬土均呈升高变化（P＜0.05），在40 d达到高峰，且土壤多酚氧化酶活性均随培育时间的延长呈先升后降的趋势，而0.07 g/mL 枯叶腐解液处理组在60 d 较重茬土显著降低（P＜0.05），重茬土的多酚氧化酶活性较对照呈降低变化。比较而言，重茬土壤和相同质量浓度枯叶腐解液对2周龄苗的根际土壤多酚氧化酶活性影响比8周龄苗大。

图5 不同质量浓度的枯叶腐解液和重茬土壤对2周龄苗根际土壤蔗糖酶活性的影响Fig.5 Effects of continuous cropping soil and leaves decay solution of different concentrationss on the activity of sucrase in the rhizosphere soil of 2 weeks P.cablinin its stem cuttings

图6 不同质量浓度的枯叶腐解液和重茬土壤对8周龄苗根际土壤蔗糖酶活性的影响Fig.6 Effects of continuous cropping soil and leaves decay solution of different concentrations on the activity of sucrase in the rhizosphere soilof 8 weeks P.cablinin its stem cuttings

图7 不同质量浓度的枯叶腐解液和重茬土壤对2周龄苗根际土壤多酚氧化酶活性的影响Fig.7 Effects of continuous cropping soil and leaves decay solution of different concentrations on the activity of polyphenoloxidase in the rhizosphere soilof 2 weeks P.cablinin its stem cuttings

图8 不同质量浓度的枯叶腐解液和重茬土壤对8周龄苗根际土壤多酚氧化酶活性的影响Fig.8 Effects of continuous cropping soil and leaves decay solution of different concentrations on the activity of polyphenoloxidase in the rhizosphere soil of 8 weeksP.cablinin its stem cuttings

2.2.5 广藿香重茬土壤、枯叶腐解液对扦插苗根际土壤过氧化氢酶活性的影响 本试验结果表明，如图9、10 所示，2 周、8 周龄苗广藿香扦插苗在0～60 d 培养期间，其0.01，0.03，0.05 g/mL 枯叶腐解液处理组过氧化氢酶活性较重茬土均呈升高变化，较对照土呈降低变化（P＜0.05），在40 d达到高峰，且土壤过氧化氢酶活性均随培育时间的延长呈先升后降的趋势，而0.07 g/mL 枯叶腐解液处理组在60 d 较重茬土显著降低（P＜0.05），重茬土的过氧化氢酶活性较对照的降低。比较而言，重茬土壤和相同质量浓度枯叶腐解液对2周龄苗的根际土壤过氧化氢酶活性影响比8周龄苗大。

图9 不同质量浓度的枯叶腐解液和重茬土壤对2周龄苗根际土壤过氧化氢酶活性的影响Fig.9 Effects of continuous cropping soil and leaves decay solution of different concentrations on the activity of catalase in the rhizosphere soilof 2 weeks P.cablinin its stem cuttings

图10 不同质量浓度的枯叶腐解液和重茬土壤对8周龄苗根际土壤过氧化氢酶活性的影响Fig.10 Effects of continuous cropping soil and leaves decay solution of different concentrationss on the activity of catalase in the rhizosphere soil of 8 weeks P.cablinin its stem cutting

3 讨论与结论

微生物在土壤中只占很小的比例，但它们在氮、磷、硫和铁等元素的循环中发挥着至关重要的作用，不仅作为影响植物生长发育的重要因子，而且与植物病害发生有密切的关联[23,26]。越来越多的研究发现，植物根际微生态的失衡可能是引起作物连作障碍的主要原因[19,27]。土壤性质也可以改变微生物群落的结构，微生物被认为是监测土壤质量变化最敏感的生物指标之一[28]。土壤性质的恶化、以及根系分泌物(包括化感物质)的积累，可能对根际土壤的微生物群落产生重大影响。在以往的研究[29]中，随着作物的持续单作，细菌和放线菌总数下降，真菌(尤其是致病真菌)的数量增加，连作会使微生物的种类和丰富度发生变化，打破其分布的平衡[30-31]，从而导致植株生长缓慢或发育不良，对后茬的产量和品质产生严重的影响[32]。张重义等[33]研究发现，地黄连作后，其根际细菌的种类及数量的有所减少，而且结构趋于单一化。许多研究认为，在连作的过程中，其连作土壤中的微生物群落构成会从“细菌型”向“真菌型”转化[34]，从而导致根际土壤微生态系统失衡[35-37]，而细菌型土壤是土质优良的一个重要指标，真菌型土壤则相反。

作物栽培生产中，由于前茬植株的残枝与土壤加上雨水的腐解作用，产生的化感物质对后茬作物的直接影响，以及由于前茬根系分泌物、残株腐解液对土壤微生态的影响，导致了连作障碍的发生[38-40]，许多作物如玉米、黄瓜等残株都能产生大量的化感物质影响自身或其他作物的生长发育[41-42]。植物可以通过根系分泌物和凋落物对土壤进行反馈调节，也同时向土壤释放化感物质，而这些化感物质也抑制植物根系和改变土壤微生物群落结构[42]。通过在非连作土壤中添加广藿香植株腐解液，结果显示，低质量浓度处理的土壤细菌和放线菌数量较非连作土和连作土的增多，真菌数量较非连作土和连作土的减少；而高质量浓度（0.07 g/mL）枯叶腐解液呈现相反的效果，这一现象验证了由于前茬的残株腐解物的积累导致的广藿香连作障碍的可能性。

土壤酶活性作为衡量土壤微生物活性的重要指标，在土壤营养循环及转化上发挥着重要作用。脲酶是土壤中的主要酶类之一，它能加速土壤有机质的化学反应，其活性高低与土壤营养物质转化能力、肥力水平、污染状况密切相关。多酚氧化酶是复合性酶，可降解土壤中酚类物质，减缓植物间的化感作用[43]。酸性磷酸酶参与分解土壤中和植株体内的有机磷，在有机磷分解和再利用方面起重要作用[44]。蔗糖酶又称转化酶，直接参与土壤有机质的代谢过程，一般情况下，土壤有机质含量越高，蔗糖酶活性越强，其活性可以作为评价土壤熟化程度和肥力水平[45]。土壤中的过氧化氢酶能促进土壤中过氧化氢的分解，其土壤中浓度大小直接表明过氧化氢对作物根系和土壤微生物的毒害作用[46]。本研究表明，连作导致土壤脲酶、酸性磷酸酶、蔗糖酶、过氧化氢酶、多酚氧化酶活性降低的变化，说明广藿香连作导致根际土壤营养循环受阻。通过在非连作土壤中添加广藿香植株腐解液，结果显示，不同质量浓度腐解液作用下，几种酶活性均较重茬土的显著降低。表明了广藿香的残株腐解对于根际土壤酶活性有显著影响，当残株凋落物在土壤中积累到一定程度时，对于根际土壤酶活性起到抑制作用。

本研究表明，广藿香连作及一定质量浓度的植株腐解液，导致了土壤细菌数量减少，真菌数量增加，并导致土壤与碳，氮，磷循环相关的几种酶活性的下降，说明连作的土壤微生物生态系统失衡、酶活性降低，可能是广藿香连作障碍产生的重要因素，其中由于残株的腐解作用引起的土壤微生物比例失衡在广藿香连作障碍中起了重要的作用。