多种动物源A型产气荚膜梭菌的分离鉴定及生物学特性

吴允正，韩春生，戴益民，2，王林康，王婧祺，张锦华，2*

（1.江西农业大学 动物科学技术学院，江西 南昌 330045；2.江西省畜禽疫病诊断与防控重点实验室，江西 南昌 330045）

【研究意义】产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens，Cp）是一种革兰氏阳性产芽胞的厌氧性梭菌，广泛存在于自然界的土壤、水源及人和动物肠道中[1]。该菌可引起人类及动物多种疾病，从坏死性肠炎到危及生命的气性坏疽。Cp的毒力与其产生的毒素有关，根据产生的致死性毒素α，β，ε和ι，通常将Cp分为A、B、C、D、E 五型[2]。A-E 型菌株均可产生α 毒素，而β 毒素存在于B 型和C 型中，ε 毒素由B 型和D 型产生，ι 毒素仅由E 型产生[3]。其他毒素基因，如肠毒素，与特定菌株无关，但与整体毒力有关，且在不同的菌株之间表现不同[4]。近来有学者提出新的分型方案，即增加了F型（α、cpe）和G 型（α、NetB）[5]。A 型Cp（CpA）能引起多种肠道腹泻性疾病：人的食物中毒和传染性腹泻，羊、牛、马、猪、犬等动物的肠毒血症，禽坏死性肠炎[6]。【前人研究进展】Cp也同样存在于健康动物的肠道,其中CpA 是分布最广泛的型[7]。α 毒素为其主要致病因子，α 毒素的本质为磷脂酶C，它具有细胞毒性、溶血活性、致死性、皮肤坏死性、血小板聚集和增加血管渗透性等多种特性[8-9]。CpA 除产生对畜禽及人有致病性的α 毒素外，有些菌株还产生β2毒素和肠毒素。β2毒素由cpb2基因编码，是Cp产生的另一种致死性毒素[10]。Waters等[11]对猪胃肠道所分离的Cp菌株携带cpb2基因的分析结果表明，β2毒素与猪腹泻和肠黏膜出血显著相关。cpb2基因分为典型和非典型2种，与最初鉴定的猪源cpb2高度同源（一般96%以上）的基因定义为典型cpb2基因，而一些同源性较低的cpb2基因（一般为60%～70%）为非典型cpb2基因[12]。猪源CpA通常携带的是典型的cpb2 基因，有研究表明，携带典型cpb2 基因的CpA 菌株与猪、马、牛、狗等多种动物的肠道疾病密切相关[13]。【本研究切入点】韩春生等[14]通过利用荧光定量PCR 技术，测定了江西地区仔猪粪便总DNA 中的CpA菌数，比较健康与腹泻仔猪肠道内Cp菌数的差异，从而推断是否由携带毒素基因的改变或菌数差异导致疾病发生。在前期的研究发现，江西地区猪源CpAcpb2 基因携带率较其它地区所报道高，达到99.5%[15]，因而，对该地区其它动物源CpA 进行相关的研究。【拟解决的关键问题】本试验在猪源CpA 研究的基础上，通过选择性培养方法分离和多重PCR 鉴定获得本地区其它动物源CpA，分别对不同动物源CpA 菌株的培养形态和cpb2基因携带、溶血特性情况进行分析比较，以期为研究CpA 在动物体内致病机制差异及CpA菌株地区特异性提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品来源与菌株

猪源CpA 菌株为本实验室分离保存，并进行了全基因测序的JXJA17 菌株（携带cpb2 基因，Genbank登录号：CP028149.1）；羊源样品采集于南昌市某养殖户健康波尔羊新鲜粪便样；鸡源样品采集于南昌市某养殖户健康肉鸡的新鲜粪便样；牛源样品采集于南昌市某农户饲养的健康青年牛的新鲜粪便样；犬源样品采集于南昌市某养殖基地健康犬的新鲜粪便样；鱼源样品采集于南昌市某水产养殖户饲养健康鱼的新鲜粪便样。多重PCR参考菌株购自中国兽医药品鉴察所，A型产气荚膜梭菌（CVCC2020）、B型产气荚膜梭菌（CVCC55）、C型产气荚膜梭菌（CVCC2041）、D型产气荚膜梭菌（CVCC82）。

1.2 主要试剂

胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂培养基（TSC）、液体硫乙醇酸盐培养基（FTG）、D-环丝氨酸、含铁牛奶培养基均购自青岛海博生物技术有限公司，DNA 聚合酶、dNTP Mixture、DL2000 DNA marker、PMD18-T、SolutionI 购自TaKaRa 公司，TOP10 感受态细胞购自北京天根生化科技有限公司，细菌基因组DNA 提取试剂盒、胶回收纯化试剂盒均购自上海生工生物工程股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 细菌的分离纯化及生化鉴定 参照猪源CpA 分离的方法，分别取少量牛、羊、鸡、犬、鱼粪便样品于2 mL的EP管（含1 mL生理盐水）中，混匀，瞬离10 s后，取100µL上清至4%D-环丝氨酸FTG中，45 ℃恒温培养10 h后接种于TSC固体培养基中，挑取灰白色、扁平圆形菌落进行革兰氏染色，镜检观察形态。参照《常见细菌系统鉴定手册》[16]和《伯杰细菌鉴定手册》[17]的方法，利用生化微量反应管对分离菌株进行生化鉴定，将分离菌株分别接种于相应的微量生化鉴定管中，置于37 ℃恒温培养箱，24 h 后观察记录结果；并将分离菌株接种于含铁牛乳培养基中，10 h后观察反应结果。

1.3.2 分离菌株的16S rDNA 鉴定 按照磁珠法细菌基因组DNA 标准抽提步骤，提取分离菌株及标准菌株的DNA。参照文献[18]，采用细菌16S rDNA 通用引物（由上海生工生物工程技术服务有限公司合成）进行PCR 扩增后，1%琼脂糖凝胶电泳30 min，并回收目的条带，连接至PMD18-T，转化后，挑取阳性克隆由上海生物工程股份有限公司测序。PCR 体系：采用25 µL 反应体系，混合引物2 µL（上、下游引物各1 µL），蒸馏水8 µL，DNA 模板2.5 µL，Mix DNA 聚合酶12.5 µL；PCR 程序：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，进行38个循环，最后72 ℃延伸10 min。

1.3.3 分离菌株多重PCR 毒素基因分型及β2 毒素基因检测 参照文献[19-20]，采用多重PCR 的方法对分离到的Cp 菌进行毒素分型，多重PCR 体系为25 µL 反应体系：10×PCR buffer 2.5 µL，1.25 µmol/L dNTP 1 µL，混合引物2 µL（α、β、ε、ι 4 对毒素基因特异性引物各0.5 µL，引物序列见表1），蒸馏水16.75 µL，DNA 模板2.5 µL，Taq DNA 聚合酶0.25 µL；反应条件：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，进行38 个循环，最后72 ℃延伸10 min。取PCR 扩增产物10 µL，于15 g/L 琼脂糖凝胶中电泳。取PCR 扩增产物10 µL，于琼脂糖凝胶中电泳并参照DL2000 DNA Marker观察并分析结果。然后采用β2 毒素基因引物（表1）对分离到的6 株CpA 进行β2 毒素基因检测，PCR产物经15 g/L 琼脂糖凝胶电泳分析结果。

表1 PCR扩增引物序列Tab.1 PCR amplified primer sequence

1.3.4 多种动物源CpA 同源性分析 多种动物源CpA 菌株各挑选1株，共6株，将测得的16S rDNA 序列用DNAStar 分析软件进行数据处理，运用NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）中Blast工具软件在GenBank中搜索同源DNA 序列并进行比较分析，利用MEGA X 软件中的邻位加入法（neighbor-joining，NJ）构建系统发育树，根据同源性大小和系统发育关系，确定待测菌株的种类归属。

1.3.5 多种动物源CpA 菌株溶血试验 挑取6 株不同动物源CpA 进行溶血试验，采用点种法，即分别吸取过夜培养的菌液2.5µL 点种至血平板，放置45 ℃恒温箱培养，每2 h 观察记录各菌株溶血现象及在血平板上的溶血圈直径，直至溶血圈直径达到最大。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离纯化及16S rDNA分子鉴定结果

收集到的牛、羊、鸡、犬、鱼粪便样品，在TSC平板上培养均可形成扁平灰白色、周围伴有浅白色浊环的圆形菌落（图1A），细菌纯化后经革兰氏染色镜检，可见菌体粗短、两端钝圆的革兰氏阳性直杆菌，无鞭毛（图1B）。所分离到的不同动物源的分离株均能发酵葡萄糖、麦芽糖、乳糖和蔗糖，产酸产气，不发酵甘露醇、液化明胶，产生硫化氢，吲哚阴性；分离菌株在含铁牛乳中呈暴烈发酵（图1C），除菌落特征和菌体形态与猪源CpA略有差别外，均符合Cp的生物特征。

图1 Cp在TSC培养的菌落形态（A）、革兰氏染色（×1 000）（B）与“爆裂发酵”现象（C）Fig.1 Results of individual morphological characteristics medium of Clostridium perfringensin TSC（A），Gram-stained（×1 000）（B）and the phenomenon of“burst fermentation”（C）

分别挑选来源于不同动物源分离菌株（将羊源、鸡源、猪源、牛源、鱼源、犬源分离菌株分别命名为C1、C2、C3、C4、C5、C6）提取DNA，利用16S rDNA 引物经PCR 扩增后均获得预期大小的片段，约为1 500 bp。通过对各分离菌株的16S rDNA 序列的BLAST 在线比对，各菌株与Clostridium perfringens（Gen Bank 登录号为CP028149.1、CP010993.1、FJ215334.1等）同源性达98%～99%，进而确定各分离菌株为Cp。

2.2 分离菌株多重PCR毒素分型及CpA同源性分析

通过与参考标准菌株比较，多重PCR 毒素基因分型结果显示：各动物源均分离到了CpA（图2）。用MEGAX软件构建的CpA种内系统发育树（图3）显示，猪源CpA、羊源CpA、狗源CpA、牛源CpA、鸡源CpA的序列聚集在同一个分支上；而鱼源CpA序列处于另一分支上，与其他动物源CpA亲源关系较远。

图2 多重PCR分型结果Fig.2 Results of multiple PCR typing

图3 基于16S rDNA序列建立的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of the isolated strains based on 16S rDNA gene nucleotide sequences

2.3 多种动物源CpA的β2毒素基因检测结果

将本试验分离到的羊源、鸡源、牛源、鱼源、犬源CpA分别暂命名为CpA-S、CpA-Ch、CpA-C、CpA-F、CpA-D，猪源JXJA17 菌株命名为CpA-P。除CpA-D 外，其中5 株CpA 携带β2 毒素基因；携带β2 毒素基因的CpA 菌株中，猪源（CpA-P）、牛源（CpA-C）、鱼源（CpA-F）的CpA 携带典型的β2 毒素基因，分离自羊源（CpA-S）、鸡源（CpA-Ch）的CpA携带非典型的β2毒素基因（图4）。

图4 β2毒素基因检测结果Fig.4 β2 toxin gene detection

图5 各CpA分离株溶血现象Fig.5 Results of hemolysis of the isolates

2.4 多种动物源CpA溶血试验结果

6株CpA在血平板上培养4 h后，CpA-S（羊源）开始出现明显的溶血现象（图5A）；培养5 h后，CpA-C（牛源）、CpA-Ch（鸡源）、CpA-F（鱼源）、CpA-D（犬源）在血平板上出现溶血现象（图5B），CpA-P 在血平板培养6 h后，开始出现溶血现象（图5C）。6株CpA 在血平板上培养24 h后，溶血圈直径均达最大，继续培养无变化，CpA-S 达30 mm，CpA-Ch、CpA-C、CpA-F 溶血圈直平均径均为20 mm，CpA-D 溶血圈平均直径为16 mm，CpA-P溶血圈平均直径为14 mm（图5D）。

3 讨论

CpA 是畜禽肠毒血症、坏死性肠炎的主要病原菌之一，对我国养殖业的发展带来了一定的危害[21]。本研究团队[15]前期研究也发现CpA 在仔猪肠炎致病过程中起着一定的作用，而CpA 又正常存在于健康动物的肠道，且江西地区健康和肠炎的仔猪肠道CpA 分离率和β2 毒素基因携带率均较高，其他动物未有报道。本试验参照猪源CpA研究方法，应用了选择培养、革兰氏染色镜检、“爆裂发酵试验”、16S rRNA基因测序和多重PCR 等方法，从其它5 种健康动物粪便样品中均分离到了CpA，说明CpA 广泛存在于健康动物的肠道中，其对动物健康和公共卫生的影响值得进一步关注。

CpA 在不同的动物体内产毒不同，致病强度也不同。CpA 对宿主健康的影响除与α 毒素相关外，β2毒素也起着非常重要的作用。本试验对江西南昌周边地区不同动物源6 株CpA 进行了cpb2 基因的检测，有5 株含有cpb2 基因，高于Álvarez 等[22]报道的cpb2 基因检出率，在一定程度上说明该地区其它动物源cpb2携带率也和猪源cpb2一样较高。Tolooe等[23]检测健康鸡源CpA携带cpb2基因的比例为97.7%，NE鸡源的CpA 菌株携带cpb2 基因的比例为94.4%；Chon 等[24]在腹泻犬源CpA 中检测出的cpb2 基因携带率（83.9%）明显高于健康犬源CpA 的cpb2 基因携带率（61.9%），本试验在健康犬源CpA 中未检测出cpb2 基因；在牛源CpA 中检测到典型cpb2基因，相比于德艳艳等[13]报道的携带非典型cpb2基因的牛源CpA 有所不同。本试验未对其它动物源CpA 和cpb2 携带率进行统计，但从随机取样的CpA 分离和cpb2 的检测结果从一定程度上说明本地区其它动物源携带率也较高，由于样本数量较少，尚有待进一步研究确定。

CpA 的致病性与其产生的毒素和溶血素有直接关系，本试验分离到的羊源CpA 在血平板出现溶血现象最快，溶血情况最为明显，是否与羊在感染Cp 后，相比于其他动物，是最容易导致疾病产生的动物之一有关，需要进一步研究。在羊群养殖过程中，应该多加注意防范产气荚膜梭菌病的发生与传播。6 种动物源CpA中，猪源CpA在血平板出现溶血现象最慢，溶血圈直径最小，这可能与猪源CpA对猪的致病性相对较弱有一定的关系，不同动物源CpA 的毒性存在着一定的差异。CpA 普遍存在环境与动物的肠道中，细菌间基因水平转移、毒素基因富集等现象[25]，警示动物源CpA 也是一种不可忽视的潜在病原菌，特别是在抗生素后时代，饲料中禁抗后，养殖业尤其需要重视CpA可能带来的危害。