中华蜜蜂离子型受体AcerIR76b、AcerIR75f.1生物信息学和差异表达分析

冯宇佳 ，杜亚丽，赵慧婷，马卫华，刘晋佳，马秀梅，张宇昊，姜玉锁*

（1.山西农业大学 动物科技学院，山西 太谷 030801；2.山西省农业科学院 园艺研究所，山西 太原 030031；3.山西农业大学 生命科学学院，山西 太谷 030801）

【研究意义】嗅觉在昆虫和环境之间起到关键的连接作用，昆虫可以利用嗅觉来检测刺激物，为其提供有关食物、捕食者和潜在配偶的信息[1-2]。研究在不同物种中编码气味受体蛋白的基因不仅可以了解这些生物之间的进化关系，还可以了解生物与环境之间的相互作用[3]。触角作为嗅觉识别系统的主要存在部位，当其感受到外界气味物质时，昆虫就会激活嗅觉感觉神经元（olfactory receptor neurons，ORNs）并将信号转化为神经冲动传递到大脑[4]。蜜蜂是一种高度社会性生活的昆虫，通过个体间合作，形成了有着完备通讯和社会分工合作的系统，以适应千变万化的自然环境，一方面能够为人类提供蜂王浆、蜂蜜、蜂花粉等高营养价值的蜂产品。另一方面，蜜蜂授粉可提高农作物产量，保护物种多样性，如经蜜蜂授粉的油菜产量是无蜂授粉区的1.4 倍之多[5-6]。中华蜜蜂是我国特有的蜂种，以其灵敏的嗅觉机制、善于采集零星蜜粉源的特点及抗逆性强的优势，在山区生态平衡和生物多样性中起着重要作用[7-8]。因此，研究嗅觉相关的基因对于深入了解蜜蜂嗅觉机制有着重要作用。【前人研究进展】目前，已经在昆虫中发现了2 个气味门控离子通道系列，即气味受体（olfactory receptor，OR）和离子型受体（ionotropic receptors，IRs），这些离子通道响应各种分子[9-11]。ORs 是拥有7 个跨膜结构的蛋白，通过与保守的共受体Orco[12-14]共表达，对信息素和一般气味产生响应。与ORs家族相比，属于离子型谷氨酸受体（iGluR）家族的IRs是拥有3 个跨膜结构的受体，其不仅可以识别胺、醛、酮、酸、一般气味以及性信息素[15-19]，还涉及到味觉识别，热敏感和湿度感触[20-21]。IRs 不仅可以单独进行表达，还可以与其它基因共同表达，即作为共表达受体（co-receptor），如黑腹果蝇中IR25a、IR8a、IR76b[22-23]。IRs 与共受体在触角神经元的表达，类似于配体特异性的OR 与它们共表达的受体ORco[24-27]。然而，有研究[28]表明，IRs 的组合模式更复杂，或许跟iGluRs 的四聚体模式相似。从Benton 等[29]采用组织特异性RT-PCR、RNA 原位杂交及转基因受体等方法，确定IR 家族在黑腹果蝇中的表达开始，正式开启了IRs 的研究。近些年来，离子型受体一直是昆虫化学生态学研究的热点，作为与嗅觉相关iGluRs 中的一类基因[18，30]，在非ORs、GRs（gustatory receptor）表达的触角腔锥形神经元中被发现[26，31]，因此，将这类新发现的基因定义为新的化学感应受体，其作用是对自然环境中的挥发性化学物质进行检测以及对细胞间化学信号过程进行勘探[26]。IRs 与离子型谷氨酸受体（iGluR）是同源的，其特征在于存在保守的配体离子通道结构域，它们与iGluR 共享保守的跨膜结构域，但在配体结合结构域差异明显[11，30]。在果蝇中，IRs 基于序列的特征被细分为两类：一类为比较保守的“触角型IRs”（A-IR），参与热敏感和嗅觉感知；另一类为具有物种特异性的“发散型IRs”（DIR）[11，28-30，32]，可能引导味觉识别。

【本研究切入点】近年来，随着基因组学、转录组学的快速发展，越来越多的昆虫IRs 被鉴定出来，如在鳞翅目昆虫棉铃虫[33]、棉贪夜蛾[16]、苹果小卷蛾[34]、印度谷螟[35]和仁扇舟蛾[36]等中分别鉴定出12 个、17个、15个和14个IRs；在膜翅目昆虫红侧沟茧蜂中鉴定出19个IRs[17]；在鞘翅目昆虫大型黑色金龟子中发现27 个IRs[37]；在直翅目昆虫蝗虫中鉴定出12 个IRs[38]；在双翅目昆虫中华按蚊和桔小实蝇发现35 和30 个IRs[39-40]，这些离子型受体主要位于细胞体和树突中，并且高度富集于树突状末端的顶端，将感觉信息传递到更高的大脑中心。这些理论基础为中华蜜蜂离子型受体的鉴定、进化和功能分析提供了条件。【拟解决的关键问题】课题组对中华蜜蜂触角（1、10、18和25日龄）转录组测序结果进行分析，筛选出10个离子型受体，本研究选择其中2 个离子型受体—IR76b 及IR75f.1，对它们编码蛋白的理化性质进行预测，并利用quantitative real-time PCR 技术对2个离子型受体在中蜂1日龄工蜂和采集蜂，1日龄雄蜂和性成熟雄蜂各部位中的表达差异进行了比较分析，以期为该蛋白的生理功能及蜜蜂的嗅觉识别机制研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试蜜蜂

山西农业大学动物科技学院实验蜂场提供试验所用的所有中华蜜蜂。选取健康无病、群势强壮、无自然分蜂倾向的中华蜜蜂蜂群，从蜂巢中抽取一张成熟的封盖子脾（新蜂将要出房）置于34 ℃人工培养箱中培养（RH：70%），待其羽化出房后采集1日龄样本；于10：00点左右（蜜蜂采集高峰期）在巢门前抓取携粉归来的工蜂（采集蜂）；于14：00—16：00在巢门口抓取回巢的性成熟雄蜂。每个样本各采集300只，进行随机分组，分为3组，蜜蜂样品分为触角、头（去除触角）、胸（去除足与翅膀）、腹和足5个部位。将所取部位立即放入含有液氮的研钵中进行研磨，呈粉末状后倒入装有1 mL Trizol液体的1.5 mL 离心管中，上下颠倒混匀，让Trizol 与样品充分接触，放入超低温冰箱（-80 ℃）中保存备用。在各个样本中，每100只蜜蜂各部位的混合样作为一个生物学重复。

1.2 主要试剂

Amp、IPTG、X-Gal 和50×TAE Buffer 等购自北京依托华茂生物科技有限公司；异丙醇、氯仿、无水乙醇等常规分析纯购自北京索莱宝科技有限公司；反转录试剂盒PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser（perfect real time）、总RNA 提取试剂盒RNAiso Plus、荧光定量试剂盒SYBR®Premix ExTaqTMII（Tli RNaseH Plus）以及DNA Marker DL 1000等购自TaKaRa 宝生物工程（大连）有限公司；PCR 反应试剂2×EsTaqMasterMix（含染料）购自北京康为世纪生物科技有限公司。

1.3 总RNA的提取及cDNA第一链的合成

按照RNA提取步骤进行各部位总RNA的提取，利用ND-1000核酸蛋白浓度测定仪测定其纯度和浓度后，根据反转录试剂盒合成cDNA 第一链，反应所需RNA 总量为1 000 ng。将所获cDNA 模板放置于-20 ℃冰箱保存备用。

1.4 引物设计

根据前期的中华蜜蜂触角转录组数据分析获得IR76b、IR75f.1基因序列（登录号为：SRR3180625）的开放阅读框ORF 序列，利用NCBI在线程序（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast）设计用于荧光定量的特异性引物。所用引物由北京华大基因科技有限公司合成，引物信息详见表1。

表1 本研究荧光定量PCR所用引物Tab.1 Primers used in this study

1.5 荧光定量PCR

根据前期设计特异性引物（表1）对该基因在中华蜜蜂1 日龄工蜂和雄蜂，采集蜂和性成熟雄蜂5 个部位中mRNA的表达水平进行qRT-PCR分析。

qRT-PCR 反应总体系为10 µL，其中SYBR Premix ExTaqTMII（2×）5 µL，ROX Refence Dye II（50×）0.2µL，上、下游引物（10µmol/L）各0.4µL，ddH2O 3µL，cDNA模板1µL。反应条件为：95 ℃预变性30 s，循环条件为95 ℃5 s，62 ℃30 s，共40 个循环。每个样本进行3 次技术重复。以各样品所对应的Arp1 的Ct值为阳性对照，获得AcerIR76b和AcerIR75f.1基因在不同样本各部位的表达情况。

1.6 生物信息学分析

利用在线软件ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）查找序列的开放阅读框，使用Lasergene软件中的EditSeq 工具预测其编码的氨基酸序列，并对其进行多种生物信息学分析。生物信息学分析所用在线软件或软件包的网址见表2。

2 结果与分析

2.1 AcerIR76b和AcerIR75f.1的蛋白特性

2.1.1 基本理化性质 运用ProtParam 在线软件预测AcerIR76b 和AcerIR75f.1 的蛋白理化性质（表3）。从表3可以看出，AcerIR76b蛋白的分子式为C2911H4543N733O792S19，在组成AcerIR76b蛋白的20种氨基酸中，含量最高为亮氨酸（Leu），所占比例为12.1%；含量最低为色氨酸，所占比例为1.5%。预测其蛋白质的分子量为63.09 ku，理论等电点pI为9.34，碱性蛋白；总平均疏水系数（GRAVY）为0.003，属于疏水性蛋白；不稳定系数为44.73，属于不稳定蛋白；脂溶系数为102.31，大于90，具有脂溶性。

AcerIR76b 蛋白的分子式为C2911H4543N733O792S19，在组成AcerIR76b 蛋白的20 种氨基酸中，含量最高为亮氨酸（Leu），所占比例为12.1%；含量最低为色氨酸，所占比例为1.5%。预测其蛋白质的分子量为63.09 ku，理论等电点pI 为9.34，为碱性蛋白；总平均疏水系数（GRAVY）为0.003，属于疏水性蛋白；不稳定系数为44.73，属于不稳定蛋白；脂溶系数为102.31，大于90，具有脂溶性。

2.1.2 蛋白基本结构预测 在线NCBI结构域分析结果表明，AcerIR76b存在两个保守的结构域，分别为Type 2 periplasmic binding fold 超家族（53-265）以及Lig_chan 超家族（162-400）。该蛋白在运输和信号转导过程中起作用，同时也作为通道门控中的初始受体存在。AcerIR76b蛋白没有信号肽，有3个跨膜结构（图1），符合典型的离子型受体结构。疏水性分析结果显示，AcerIR76b的氨基酸序列中，第35位氨基酸Score值最低为-2.900，第11位氨基酸Score最高为3.122；存在许多相对明显的疏水区域（Score为正值的区域）,推测其可能为疏水蛋白。亚细胞定位结果表明，AcerIR76b蛋白可能存在于内质网（39.1%）、线粒体（13.0%）、质膜（30.4%）、高尔基体（4.3%）、空泡（4.3%）、胞外包括细胞壁（4.3%）和分泌系统的囊泡中（4.3%）中，表明该蛋白属于细胞质蛋白。

表3 AcerIR76b和AcerIR75f.1蛋白的理化性质分析Tab.3 Physical and chemcial properties of characteristics for AcerIR76b and AcerIR7f.1

图1 AcerIR76b跨膜区域预测图Fig.1 AcerIR76b transmembrane region prediction

图2 AcerIR75f.1跨膜区域预测图Fig.2 AcerIR75f.1 transmembrane region prediction

在线NCBI 结构域分析结果表明，AcerIR75f.1 存在一个保守的结构域，即Type 2 periplasmic binding fold超家族（175-384）。该蛋白可作为运输，信号转导和通道门控中的初始受体存在。AcerIR75f.1蛋白没有信号肽，有3个跨膜结构（图2），符合典型的离子型受体结构。疏水性分析显示，AcerIR75f.1的氨基酸序列中，第373位氨基酸Score值最低为-3.033，第352位氨基酸最高为3.078；存在多个比较明显的疏水区域（Score 为正值的区域）。亚细胞定位结果表明，AcerIR75f.1 蛋白可能存在于内质网（44.4%）、线粒体（22.2%）、质膜（22.2%）和分泌系统的囊泡中（11.1%），主要集中在分泌途径上，说明该蛋白属于细胞质蛋白。

2.2 AcerIR76b mRNA组织表达分析

如图3 所示，AcerIR76b 的转录本在1 日龄工蜂和采集蜂，1 日龄雄蜂和性成熟雄蜂各部位中均有表达，在触角中的表达量远远高于其它部位，呈极显著差异（P＜0.01）。在其它部位中，1日龄工蜂腹部的表达量和采集蜂相比，呈显著差异（P＜0.05）；1日龄雄蜂足部的表达量同性成熟雄蜂相比，同样呈显著差异（P＜0.05）。除此之外，AcerIR76b在剩余部位中均呈微量表达。

图3 中华蜜蜂AcerIR76b在1日龄工蜂和采集蜂，1日龄雄蜂和性成熟雄蜂不同部位中的相对表达量Fig.3 Relative expression level of AcerIR76b mRNA in different parts of 1-day-old workers and forager，1 day and sexually mature drones of Apis cerana cerana

2.3 AcerIR75f.1 mRNA组织表达分析

如图4所示，AcerIR75f.1的转录本在1日龄工蜂和采集蜂，1日龄雄蜂和性成熟雄蜂各部位中均有表达。在1 日龄工蜂和采集蜂中，该基因均在触角中高表达，1 日龄工蜂触角的表达量极显著高于其它部位（P＜0.01），而在采集蜂中，触角和胸部的表达量差异不明显，但均极显著高于其它部位（P＜0.01）。

图4 中华蜜蜂AcerIR7f.1在1日龄工蜂和采集蜂，1日龄雄蜂和性成熟雄蜂不同部位中的相对表达量Fig.4 Relative expression level of AcerIR75f.1 mRNA in different parts of 1-day-old workers and forager，1 day and sexually mature drones of Apis cerana cerana

在1 日龄雄蜂和性成熟雄蜂中，除腹部外，性成熟雄蜂各部位的表达量均极显著高于1 日龄雄蜂（P＜0.01），其中，足部的表达量极显著地高于其它部位。1日龄雄蜂各部位的表达量均呈微量表达。

3 讨论与结论

蜜蜂是一种高度社会性生活的昆虫，通过个体间合作，形成了具有高度发达的通讯和社会分工的合作系统，能适应多变的环境条件。在本课题组前期中华蜜蜂触角转录组测序数据的基础上，成功从中获得了完整的AcerIR76b及AcerIR75f.1的ORF序列。生物信息学分析表明，AcerIR76b全长为1 635个碱基，编码545个氨基酸，有3个跨膜结构；AcerIR75f.1全长为1 686个碱基，编码562个氨基酸，同样有3个跨膜结构，这与意大利蜜蜂[41]、黑腹果蝇[11]等的预测结果相一致，属于典型的离子型受体结构，因此可以确定AceIR76b与AcerIR75f.1均为中华蜜蜂的离子型受体基因。

本研究qRT-PCR 结果显示，AcerIR76b在工蜂和雄蜂触角中的表达量均极显著的高于呈微量表达的其它部位（P＜0.01），与亚洲小车蝗Oedaleus asiaticus中的表达模式相同[42]，但其并非只在嗅觉器官——触角中表达，所以推测AcerIR76b 属于“发散型IR”。AcerIR75f.1 在1 日龄工蜂和采集蜂，1 日龄雄蜂和性成熟雄蜂中的表达模式不同：在1日龄工蜂和采集蜂中，该基因在触角中高表达，同时也在采集蜂胸部高表达，呈极显著差异（P＜0.01），而在1 日龄雄蜂和性成熟雄蜂中，该基因在足部高水平表达，呈极显著差异（P＜0.01），且性成熟雄蜂各个部位的表达量均极显著高于1日龄雄蜂（腹部除外），由此推测，AcerIR75f.1同样属于“发散型IR”。

有关离子型受体IRs 的功能研究最初集中在黑腹果蝇上，且仅限于嗅觉，但最近的研究已扩展到了听觉，味觉，温度和湿度的感测，如：IR92a1主要介导黑腹果蝇对氨气和胺的感知[38]；IR64a主要介导果蝇嗅觉系统中酸性物质的检测[30]；IR21a 参与黑腹果蝇幼虫的遇冷趋避[20]；当IR93a 与IR21a 和IR25a 结合时，同样介导幼虫的温度感知[20-21]；IR25a、IR93a、IR68a和IR40a参与果蝇的湿度感应[20`43]。有关IR76b的功能研究发现，该受体单独存在时，其不仅可以感受咸味，还具有感受氨基酸的味觉功能；当IR20a 与IR76b共表达时，具有甜味感觉功能；IR41a与IR76b共表达时，主要介导对多胺的识别[44]；IR25a和IR76b共表达时，介导雌性的酸味味觉受体神经元（GRNs）的活化[45]。由此可见，IR76b 不仅具有嗅觉功能，同时也具备味觉感知功能。但关于AcerIR75f.1 功能的研究还尚未见报道，因此只能基于本研究qRT-PCR结果，推测该基因不仅在嗅觉上发挥一定作用，在雄蜂味觉感知中也占据着重要地位。

在一个蜂群里，工蜂的数量最多，担任了除产卵以外的所有工作，1日龄工蜂主要在巢内进行保温孵卵、清理产卵房的工作；而采集蜂作为壮年个体，主要在巢外进行采集花蜜、水、花粉、蜂胶及巢门防卫的工作[46]，因此，有更多机会外出飞行，接触不同种类的气味分子。雄蜂的唯一任务就是保证与处女王的交配，在交配季节，性成熟的雄蜂会自动聚集在某空域中，招引处女王[47]。本研究qRT-PCR 结果显示，AceIR76b 和AcerIR75f.1 均在工蜂和雄蜂足部有表达，因此，推测该基因不仅起嗅觉识别功能，在味觉感知中也同样发挥着一定作用。

本研究通过对AcerIR76b 和AcerIR75f.1 基因的生物信息学分析，结果表明，2 个基因均具有昆虫离子型受体的典型特征。荧光定量表达结果显示AcerIR76b mRNA 在工蜂和雄蜂触角的表达极显著地高于其它部位（P＜0.01），在其它部位仅微量表达；AcerIR75f.1 mRNA 在工蜂触角中高表达，在雄蜂足部高表达，推测2 个基因不仅起嗅觉识别功能，在味觉感知中也同样发挥着一定作用，具体功能还有待进一步研究。