犬源大肠埃希菌系统进化分群及相关毒力基因检测

2020-09-07朱子琦但佳明龙佳丽蒋绍齐黄晓山刘海峰周紫峣马晓平彭广能王玉飞黄克和钟志军

江西农业大学学报 2020年3期

朱子琦，魏斌，但佳明，龙佳丽，蒋绍齐，黄晓山，刘海峰，周紫峣，马晓平，彭广能，王玉飞，黄克和，钟志军*

（1.四川农业大学动物医学院/动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川成都 611130；2.山西省清徐县动物疾病预防控制中心，山西清徐 030440；3.中国人民解放军总医院第三医学中心检验科，北京 100039；4.南京农业大学动物医学院，江苏南京 210095）

【研究意义】大肠埃希菌是一种在人和动物体内的正常寄生的革兰氏阴性菌，属于条件性致病菌。致病性大肠埃希菌可引起以腹泻和败血症等为主要症状的初生幼犬急性肠道疾病；大肠埃希菌可引起成年犬、猫的肾盂肾炎，尿道炎也有报道[1]。犬类作为伴侣动物，长期与人类接触，因此容易出现大肠埃希菌的水平传播。对犬源大肠埃希菌进行深入研究，可以为人兽共患病的预防提供依据。【前人研究进展】大肠埃希菌系统进化分群根据其致病力、耐药性及毒力因子分布差异等可分为A、B1、B2和D群系。A和B1群系主要为共生型大肠埃希菌，B2和D群系为包含较多毒力因子且与致病性相关的大肠埃希菌[2]。大肠埃希菌的毒力基因与其致病性有着密切联系，其中铁摄取类（sitA、irp2、fyuA、iroN）、黏附素类（eaeA、fimC、papA、tsh）、毒素类（hlyF、hlyA、elt、eatA、estB、astA）和保护素类（iss、ompT、cvaC）是犬类大肠埃希菌的主要致病因子，在其侵袭宿主组织并引起病变过程中扮演着重要角色。文娟等[15]研究发现fimC、sitA和ompT基因在临床健康分离株和腹泻分离株的检出率均超过40%。菌株主要分布于A 组（35.40%，59/156）；其次D 组（29.49%，46/156）和B1 组（20.51%，32/156）；B2 组菌株分布最少（12.18%，19/15），B2 和D 2 组肠杆菌占总分离数的41.67（65/15）。【本研究切入点】对毒力基因的研究有助于对大肠埃希菌的致病性研究提供依据；本试验对前期实验室从成都市分离的30 株腹泻犬源大肠埃希菌系统进化分群以及毒力基因进行检测。【拟解决的关键问题】本研究的研究结果为犬源大肠杆菌病的致病机理和防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

30株大肠埃希菌为本实验室于2016年在成都地区分离于腹泻犬的大肠埃希菌[3]。

2×TaqPCR MasterMix、DL2000 DNA Marker及细菌基因组DNA提取试剂盒购于天根生物试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细菌DNA的提取采用天根公司细菌基因组DNA提取试剂盒进行提取。

1.2.2 细菌系统进化分群以及毒力基因引物序列参考文献[4-12]设计引物，引物序列见表1。引物由上海英俊技术生物有限公司合成。PCR反应条件参考文献[4-12]进行。

1.2.3 大肠埃希菌系统进化分群鉴定参考Clermont 等[12]建立的方法，采用PCR 扩增chuA、yjaA和TspE4.C2基因，根据扩增结果将大肠埃希菌分为A群系（chuA和TspE4.C2基因扩增结果均为阴性）、B1群系（chuA扩增结果为阴性而TspE4.C2阳性）、B2 群系（chuA和yja扩增结果均是阳性）和D 群系（chuA阳性而yjaA阴性）。

2 结果与分析

2.1 大肠埃希菌系统进化分群结果

根据大肠埃希菌系统进化分群鉴定，30株犬源大肠埃希菌分为3种类型，A群系占53.33%（16/30，菌株编号1、2、6、7、9、10、11、13、18、25、27、34、36、39、40和41）；B1群系占23.33%（7/30，菌株编号3、4、5、8、21、23和38）；D群系占23.33%（7/30，菌株编号14、28、29、31、32、33和37）；未检出B2群系。

表1 细菌系统进化分群与毒力基因引物序列Tab.1 Primers used for phylogenetic clustering and virulence gene application in this study

2.2 犬源大肠埃希菌中毒力基因的PCR扩增结果

17种毒力基因中fimC检出率最高为96.67%（29/30）；其次为sitA66.67%（20/30）；ompT为46.67%（14/30）；fyuA为16.67%（5/30）；iss为16.67%（5/30）；Irp2为16.67%（5/30）；iroN为13.33%（4/30）；未检出毒力基因papA、tsh、hlyF、hlyA、cvaC、astA、estA、estB、eaeA、elt。PCR扩增结果见图1-7。

图1 部分fimC PCR产物电泳结果Fig.1 Agarose gel electrophoresis results for PCR products of fimC

图2 部分ompT PCR产物的电泳结果Fig.2 Agarose gel electrophoresis results for PCR products of the ompT

图3 部分iroN PCR产物的电泳结果Fig.3 Agarose gel electrophoresis results for PCR products of the iroN

图4 部分Irp2 PCR产物的电泳结果Fig.4 Agarose gel electrophoresis results for PCR products of the Irp2

2.3 大肠埃希菌17种毒力基因携带情况

由表2 可知，30 株分离株共有11 种毒力基因组合形式，其中主要为4 种组合形式：fimC（占16.67%，菌株编号为1、2、6、9、11）、fimC+sitA（占16.67%，菌株编号为5、10、23、25、28）、fimC+ompT（占16.67%，菌株编号为13、32、33、38、41）、fimC+sitA+iss+ompT（占16.67%，菌株编号为14、31、36、37、39）。

2.4 不同种群大肠埃希菌毒力基因的携带情况

由表3 可知，不同种群大肠埃希菌所携带的毒力基因存在差异，根据毒力基因携带情况进行分析，fimC、sitA在3种分型中均占50%以上，其中毒力基因fimC在3种分型中菌占最高比例；Irp2、fyuA、iroN携带率均在50%以下。根据不同群系携带毒力基因的情况进行分析，A、B1 群系含有检出的所有毒力基因，D群系不携带Irp2、fyuA、iroN。

图5 部分iss PCR产物的电泳结果Fig.5 Agarose gel electrophoresis results for PCR products of the iss

图6 部分sitA PCR产物的电泳结果Fig.6 Agarose gel electrophoresis results for PCR products of the sitA

图7 部分fyuA PCR产物的电泳结果Fig.7 Agarose gel electrophoresis results for PCR products of the fyuA

3 讨论

本试验对30 株腹泻犬源大肠埃希菌进行系统进化分群研究，结果显示30 株分离株分别属于A（53.33%）、B1（23.33%）、D（23.33%）群系，其中优势群系为A 群系，这与周陆红等[13]研究结果一致。A与B1群系属于宿主依赖性致病毒力较弱不易直接引起宿主患病，但当宿主的免疫力降低时则会引起感染。同时A 与B1 群系属于肠致病型，这与本试验菌株是腹泻犬源大肠埃希菌相符合。提示要注意大肠埃希菌A 与B1 群系在临床中对犬致病的影响。

大肠埃希菌是引起犬肠道疾病的主要病原，其致病性主要与菌毛、毒素、抗血清活性因子、侵袭性酶、铁摄取系统以及生物膜形成的相关蛋白有关，它们能帮助细菌定植，形成生物膜，捕获铁等基本营养物质，进而造成动物肠道上皮损伤，增强大肠杆菌引起全身感染的能力。大肠杆菌产生特定的毒力因子是决定其致病性的关键因素[4]。本试验中fimC（96.67%）、sitA（66.67%）、ompT（46.67%）毒力基因检出率比较高，表明这些毒力因子与大肠埃希菌引起腹泻的致病性有关。黏附素（fimC）是肠产毒素型大肠杆菌（ETEC）的主要毒力因子，初生幼畜被ETEC 感染后常因剧烈水样腹泻所致脱水而死亡。黏附素具有帮助ETEC 黏附于宿主小肠上皮细胞的能力，进而使其在肠内定居、繁殖和产生毒素，发挥致病作用[14]。本研究中黏附素类（fimC）的检出率高于文娟[15]的研究结果，可能是本次试验的菌株全与腹泻犬源相关。细菌的存活需要铁元素，铁转运类基因（sitA）是细菌运载铁离子的重要基因，本试验中铁转运类基因（sitA）高于文娟[15]的研究结果，推测sitA在大肠杆菌致病过程中发挥着重要的作用。保护素类毒力基因（ompT、iss）赋予细菌摄取铁和抗血清的作用，编码与组织侵袭相关的毒力因子，与铁的摄取与调节有直接或间接的关系[16]。本试验中保护素类（ompT、iss）的检出率与纪雪等[17]的研究结果相一致，高于文娟[15]的研究结果。铁摄取类基因（iroN、fyuA、Irp2）是细菌毒力岛（HPI）的重要毒力基因，常作为检测HPI是否存在的指示基因[18]。HPI 也是大肠杆菌重要的毒力因子，HPI 的检出率越高，菌株的致病率也明显越高[19]。本试验中检出毒力基因fyuA（16.67%）、Irp2（16.67%）、iroN（13.33%），结果与纪雪等[17]的研究基本一致，略低于文娟[15]的研究结果。此外，笔者进一步分析了毒力基因组合的组合形式，发现本次分离的大肠埃希菌毒力基因组合以fimC（16.67%），fimC+sitA（16.67%），fimC+ompT（16.67%），fimC+sitA+iss+ompT（16.67%）4 种组合形式为主。蒋春阳等[19]研究中也检出fimC（18.2%），与本研究一致，但其研究表明毒力基因以hlyA和sfa为主，这种差异可能与其样品为患子宫蓄脓症犬的子宫内容物有关。国外研究结果也证实菌株的致病性与毒力基因组合方式有关[20]，故本次分离株的致病性差异需要进一步研究。本试验对30 株分离于成都地区腹泻犬源大肠埃希菌的毒力基因及种群分型进行了系统研究，为进一步研究犬源大肠埃希菌毒力基因与致病性提供参考。