蒲翘散发酵条件的筛选及其产物对肉雏鸡生长性能的影响

刘琼丹，黎 敏，朱兆荣,2，刘 娟,2

(1.西南大学动物科学学院中药创新实验室，重庆 荣昌 402460 ； 2.重庆市高校兽医科学工程研究中心中兽药创新实验室，重庆 荣昌 402460)

雏鸡在生长发育过程中，由于体温调节机制不健全、消化系统发育不健全、抵抗力弱等生理特点，使其容易遭受外邪入侵，从而导致发病，严重影响雏鸡的生长发育，给养殖业带来了很大的经济损失。研究表明，中药具有防病促生长的作用[1-3]。故根据中药配伍原则，选用自拟方蒲翘散为受试药物，主要由蒲公英、金银花、连翘等中药材组成，此中药方具有清热解毒、理气健脾等功效，蒲公英、金银花、连翘具有提高机体免疫的功能[4-6]。由于中草药的细胞具有细胞壁，常规的一些提取方法很难将其破坏，导致包浆中的有效成分提取不充分，提取率降低、使中草药药效降低[7]。大量研究表明，经微生物发酵后，有效成分释放出来，可以使中草药有效成分提取率提高，毒性降低、药效提高。枯草芽孢杆菌是生存能力强的好氧菌，具有调节肠道菌群平衡、增强动物免疫力、提高生长性能等诸多功能，被认为是最理想的益生菌[8]，因此广泛应用于中药发酵的研究。本试验通过自拟方蒲翘散，以枯草芽孢杆菌作为发酵菌种，筛选出最佳发酵条件，并通过动物体内试验对发酵处方的药效进行初步观察，为蒲翘散发酵物的临床用药提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 菌种及药材 枯草芽孢杆菌(由本校微生物实验室提供)，蒲公英、金银花、连翘等，购自重庆市迪盛医药有限公司。

1.2 培养基和试剂 营养琼脂培养基(BR，批号:20160408)、营养肉汤培养基(BR，批号:20160116)，均购自北京奥博星生物技术责任有限公司；芦丁对照品，购自中国食品药品检定研究院，批号:100080-201409。

1.3 主要仪器 立式压力蒸汽灭菌器(型号：YXQ-LS-30S)，购自上海博讯实业有限公司；隔水式恒温培养箱(型号：GNP-9080)，购自上海精宏实验设备有限公司；MLL-16A型低温离心机，购自海菲恰尔分析仪有限公司。

1.4 实验动物 1日龄健康红羽肉鸡，公母各半，初始平均体重为51.29 g/只，由西南大学荣昌校区实验动物科提供。

1.5 蒲翘散发酵条件筛选

1.5.1 发酵菌种的活化 将保存的枯草芽孢杆菌接种到营养肉汤液体培养基的试管中，于37 ℃培养24 h，传代2次后的菌液用钩菌环将其接种于营养琼脂固体培养基，于37 ℃培养24 h，挑取单个菌落于装有10 mL液体培养基的试管中，于37 ℃培养24 h，置4 ℃冰箱中备用。

1.5.2 种子液的制备 将活化好的枯草芽孢杆菌按1%的量接种于装有营养肉汤液体培养基，于震荡培养箱，温度37 ℃，转速180 r/min培养24 h，置4 ℃冰箱保存，备用。

1.5.3 芦丁标准曲线制备 取芦丁对照品9.7 mg，精密称量，置于50 mL量瓶中，加适量的甲醇溶解，再加蒸馏水至刻度，摇匀，即得对照品标准溶液(每1 mL含芦丁0.194 mg)。精密量取对照品溶液，0.0、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL和3.0 mL，分别置10 mL容量瓶中，各加蒸馏水至3 mL，加5%亚硫酸钠溶液0.4 mL，混匀，放置6 min；再加10%硝酸铝溶液0.4 mL，混匀，放置6 min；加4%氢氧化钠溶液4.0 mL，再加蒸馏水至刻度，摇匀，放置15 min，以加对照品溶液0.0 mL的试剂为空白，质量浓度为横坐标，计算回归方程，制定标准曲线，作为中药发酵物黄酮含量检测备用。

以相应试剂为空白，在波长为510 nm处测吸光度，得芦丁标准曲线图，见图1，得到回归方程：y=12.242x-0.010 6，R2=0.998 3。结果表明，芦丁检测浓度在0.005～0.06 mg/mL 范围内与吸光度呈良好线性关系。

图1 标准品芦丁的标准曲线

1.5.4 发酵条件优化 采用单因素试验方法对初始pH值、发酵温度、接菌量、转速、时间进行优化，每组3个平行，并测定总黄酮含量，确定最佳发酵条件。

(1)发酵培养基初始pH值：对发酵培养基发酵前的pH值(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)进行筛选。(2)发酵温度：对不同温度(25、30、35、40 ℃和45 ℃)进行筛选。(3)发酵接菌量：对不同接菌量(0.5%、1%、2%、4%、6%、8%)进行筛选。(4)发酵转速：对不同转速(120、150、180、210 r/min 和240 r/min)进行筛选。(5)发酵时间：对不同时间(12、24、36、48 h和60 h)进行筛选。

1.5.5 优化发酵条件验证 将以上优化后的发酵条件组合，进行验证试验，并将蒲翘散药液与发酵液进行比较，每组3个平行，发酵后对其总黄酮含量进行测定。

1.6 对肉雏鸡生产性能和免疫功能的影响

1.6.1 动物分组与处理 用1日龄健康红羽肉雏鸡180只，随机分为空白组、菌液组(菌液组)，发酵药液组(即未经灭菌处理的)I、II、III组，发酵药液灭菌组(IV组)，共6个组，每组设3个重复，每个重复10只。各组处理为：空白组肉鸡饲料中添加0.5%的蒸馏水；菌液组添肉鸡饲料中加0.5%的菌液(含菌量与试验II组一致); 发酵药液I、II、III组肉鸡饲料中分别添加蒲翘散发酵液0.25%、0.5%、1.0%；发酵药灭菌组肉鸡饲料中添加0.5%的经灭菌处理的蒲翘散发酵物。8日龄接种新-流二联苗，21日龄接种传染性囊病活疫苗，以点眼滴鼻方式接种，饲料配方及营养见表1。

表1 基础日粮组成及营养水平 (%)

1.6.2 测定指标及方法

1.6.2.1 生长性能指标 试验期间，每天记录饲喂饲料量，剩余饲料量，洒落饲料量，并计算出每天的实际采食量。计算各阶段平均日增重、料重比。平均日增重=(阶段末重-阶段始重)/阶段天数；料重比=阶段实际总采食量/阶段总增重。

1.6.2.2 免疫器官指数 将上述46日龄雏鸡采血后致死，取脾脏、法氏囊称重，计算免疫器官指数。免疫器官指数=免疫器官重量(g)/宰前空腹活重(100 g)。

1.7 数据处理 采用Excel对数据进行收集和简单处理，再用SPSS 22.0统计软件用方差分析度数据进行系统分析，结果采用平均值±标准差。

2 结果

2. 1 发酵条件优化后对蒲翅散发酵液中总黄酮含量的影响 由图2(A)可知，随着发酵培养基初始pH值的增大，蒲翘散发酵液中总黄酮的含量先增加后降低，当初始pH值为5.0时蒲翘散发酵液中总黄酮含量达到最高，发酵培养基初始pH值在5.0～5.5时，蒲翘散发酵液中的总黄酮含量变化不明显，由于其发酵培养基发酵前未经调节的pH值在5.2～5.4，最后确定发酵培养基初始pH值5.2～5.4为最佳。由图2(B)可知，蒲翘散发酵液中总黄酮含量随温度的增加呈现先增加后降低，当发酵温度为35 ℃时蒲翘散发酵液中总黄酮含量达到最高，因此，采用35 ℃为最佳发酵温度。由图2(C)可知，当接菌量为2%时蒲翘散发酵液中总黄酮含量达到最高，超过2%时蒲翘散发酵液中总黄酮含量反而降低，因此，采用2%为最佳发酵接菌量。由图2(D)可知，随着摇床转速的增加，蒲翘散发酵液中总黄酮含量也逐渐增加，在210 r/min时总黄酮含量达到最高，转速超过210 r/min时，蒲翘散发酵液中总黄酮含量反而降低。因此，采用转速为210 r/min为最佳发酵转速。由图2(E)可知，总黄酮含量随着时间的不同呈现出一定的周期性变化，每隔24 h总黄酮含量上升后又下降，分别在24 h和48 h处出现峰值，但在24 h时蒲翘散发酵液中总黄酮含量最高，发酵时间相比较短，因此，采取发酵24 h为最佳发酵时间。图2(F)可知，发酵后蒲翘散发酵液中总黄酮含为83.150 mg/g，未发酵蒲翘散中总黄酮含量为79.065 mg/g，发酵比未发酵蒲翘散总黄酮提取含量增加5.17%。

2.7 蒲翘散发酵液对肉雏鸡生长性能的影响 试验结果显示，在0～21日龄阶段，各试验组肉雏鸡的平均日增重高于空白组，差异极显著(P<0.01)。各试验组肉雏鸡的料重比低于空白组，差异极显著(P<0.01)。试验Ⅱ组肉雏鸡的平均日增重与空白组比较增加27.3%，料重比与空白组比较降低12.1%。在21～46日龄阶段，与空白组比较，各试验组平均日增重增加，差异极显著(P<0.01)；与空白组比较，菌液组肉雏鸡平均日增重增加18.5%，试验Ⅰ组肉雏鸡增加8.7%，试验Ⅱ组肉雏鸡增加7.0%，试验Ⅲ组增加5.7%，试验Ⅳ组肉雏鸡增加19.8%。各试验组的料重比与空白组比较，差异显著(P<0.05)，其中试验Ⅱ组的料重比最小，比空白组降低18.2%。见表2。

2.8 发酵物对肉雏鸡免疫器官指数的影响 结果显示，与空白组比较，试验Ⅱ组和Ⅳ组肉雏鸡的脾脏指数，差异显著(P<0.05)。各试验组肉雏鸡的法氏囊指数，差异都不显著(P>0.05)，其中除试验Ⅱ组外，其他组肉鸡的法氏囊指数都高于空白组。综合上述结果可以得到蒲翘散发酵物对肉雏鸡的免疫器官发育都有一定的促进作用，其中蒲翘散发酵经灭菌的药物对肉雏鸡脾脏和法氏囊的增重效果最好，见表3。

表2 蒲翘散发酵物对肉雏鸡生长性能指标影响

3 讨论

蒲翘散主要由蒲公英、金银花、连翘等中药材组成，具有清热解毒、理气健脾等功效。研究表明，大多数清热解毒的中药具有抗菌、抗病毒、增强机体免疫力等作用，理气健脾的中药可以调节肠胃、促进消化[9]，因此根据中药处方配伍原则，选择蒲翘散作为受试药物。

枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是我国农业部允许作为饲料添加剂的2种芽孢杆菌之一，现已在畜牧业、饲料行业中广泛应用。枯草芽孢杆菌作为一种益生菌被研究者们广泛应用于各种发酵研究，在发酵过程中，适宜发酵条件对菌株的发酵水平有很大影响，在不同的发酵条件下产酶量也不同。枯草芽孢杆菌自身生长也需要一定的条件，如温度、pH值、发酵时间、发酵转速等都影响其生长。pH值会影响微生物对培养基营养物质的吸收，最终影响微生物的生长和代谢产物的合成[10]。温度在微生物生长过程中通过影响其胞内生物大分子的活性来影响微生物的代谢活动，温度太高或太低都会对微生物的生长造成不利的影响。接种量过小容易造成发酵周期的延长，而接种量过大又会引入较多的代谢废物及快速的消耗营养物质，影响诱导酶的合成[11-13]。黄酮类物质是许多中药的活性成分，具有抗菌、抗病毒、抗氧化等作用[14]。本试验自拟方蒲翘散，其主要成分蒲公英、金银花、连翘等含有黄铜成分[15-17]，因此，选用黄酮含量作为发酵条件优化的判断依据。本试验得出，蒲翘散发酵条件为：发酵培养基初始pH值5.2～5.4，温度35 ℃，接菌量2%，转速210 r/min，发酵24 h。优化后的初始pH值和温度与文献[18]研究的枯草芽孢杆菌发酵条件初始pH值为6.0，温度为35 ℃结果相近。接菌量和发酵转速与文献[19]研究的枯草芽孢杆菌B908的发酵结果(接菌量2%，摇床转速200 r/min)相似。发酵优化后总黄酮含量提高5.17%，与文献[20]结果一致。

表3 蒲翘散发酵物对肉雏鸡免疫脏器指数的影响 (g/100 g)

发酵中药主要被广泛应用于畜禽生产，主要用于抗病、促生长等，通常将发酵后的中药添加到饲料中，来代替抗生素的使用。发酵中药组对肉雏鸡的生产性能作用显著高于中药组[21]。张凯等研究表明，发酵黄芩提取物能显著降低乳酸脱氢酶的活性[22]。发酵黄芪药渣能够提高青脚麻鸡的生产性能以及免疫力水平[23]。本试验表明，蒲翘散发酵药物对肉雏鸡的生长有促进作用，提高动物的生产性能。结果与上述研究一致，但不同添加剂量对肉雏鸡的生长性能的影响有所不同，在添加剂量为0.5%时最为合适。

Rivas等研究发现，胸腺、脾脏和法氏囊的重量可以用来衡量雏鸡的免疫力水平[24]。法氏囊是诱导B淋巴细胞分化和成熟的场所；胸腺是T淋巴细胞分化成熟的免疫中枢器官，胸腺会因为年龄的增长而逐渐退化；禽类的脾脏主要参与免疫功能。本试验结果显示，试验组肉雏鸡的脾脏指数和法氏囊指数均有不同程度的增加，与文献[25]结果一致，证明蒲翘散发酵液能促进免疫器官的发育。

综上所述，蒲翘散的最佳发酵条件为发酵培养基的初始pH值5.2～5.4，温度35 ℃，接菌量2%，转速210 r/min，发酵24 h，发酵优化后总黄酮含量提高5.17%。发酵后能提高肉雏鸡的生长性能并对免疫器官的生长发育也有一定的促进作用。