非小细胞肺癌罕见驱动基因突变特点及其与临床病理特征的相关性

王 也，杨 磊，于 芳，姜睿盈，王 蓓，赵 玲，陈 皇，王晓伟，钟定荣

（中日友好医院 病理科，北京 100029）

肺癌是全世界发病和死亡率居于高位的恶性肿瘤[1]，其中绝大部分肺癌的病理类型为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）[2]。目前，随着各种驱动突变的发现以及相应靶向药物的问世，使得非小细胞肺癌患者特别是晚期肺腺癌患者获得了更多的治疗方案。同时，检测技术的不断更新换代，也使一些罕见的驱动基因靶点慢慢进入了大家的视线，如ROS1、RET、HER2、PIK3CA 等。与之对应的靶向药物也随之进入临床研究中，并取得了明显的疗效。NCCN（美国国立综合癌症网络）指南中明确指出：在进行靶向药物治疗之前需要对基因突变的状态进行检测，以保证为患者提供更为精准的治疗方案。其中多数驱动基因的突变可以通过荧光实时定量PCR（RT-PCR）的方法进行检测[3]。本文通过回顾性收集630 例手术切除的非小细胞肺癌标本，使用RT-PCR 法检测EGFR、ALK、ROS1、RET、KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA 以及HER2 基因的突变情况，并对这些基因中的罕见突变或罕见突变位点进行总结分析。

1 对象与方法

1.1 研究对象

收集中日友好医院病理科2018年11月～2019年12月期间送检的非小细胞肺癌患者手术标本630 例。患者中男264 例（41.90%），女366例（58.10%）；年龄26～82 岁，平均59.72 岁，中位年龄61 岁。

组织学分型：原位腺癌9 例（1.43%）、微浸润腺癌99 例（15.71%）、非黏液性浸润性腺癌471例（74.76%）、黏液腺癌33 例（5.24%）、鳞癌14 例（2.22%）、大细胞癌4 例（0.63%）。

非黏液性浸润性腺癌包括：附壁为主型80 例（16.99%）、腺泡为主型276 例（58.60%）、乳头为主型62 例（13.16%）、实体为主型41 例（8.70%）以及微乳头为主型12 例（2.55%）。

1.2 基因检测方法

标本经过肿瘤含量评估后，切8～10μm 厚的石蜡卷5 片，装入1.5ml EP 管中。脱蜡后，使用FFPE DNA/RNA 核酸共提取试剂盒（厦门艾德）进行DNA 和RNA 的提取。并用超微量紫外分光光度仪（日本岛津）进行浓度测定。配制PCR 体系时，将DNA 浓度稀释至2～3ng/μl，RNA 原始浓度上机。RT-PCR 使用扩增阻滞突变系统（amplification refractory mutation system，ARMS）法，试剂盒为5 种突变基因检测试剂盒（厦门艾德）。实时定量PCR 仪为ABI 7500（美国）。PCR 程序：第一阶段42°C 5min，95°C 5min，1 个循环；第二阶段95°C 25s，64°C 20s，72°C 20s，10 个循环；第三阶段93°C 25s，60°C 35s，72°C 20s，36 个循环。在第三阶段60°C 时收集FAM 和VIC 荧光信号。结果参照试剂盒说明书进行判读。

1.3 统计学方法

应用SPSS22.0 软件进行统计学分析，相关性分析采用χ2检验或Fisher 精确检验以及Logistic回归分析。肿瘤大小为单向等级有序资料，采用秩和检验。

2 结果

2.1 驱动突变检测结果

荧光定量PCR 检测结果见图1～图12（见封二），驱动基因突变时会出现相应的一条S 型扩增曲线（图1～图7），没有突变时则没有曲线（图8）；融合基因检测有内质控曲线一条（图9～图12中黑色曲线），发生融合时还有出现另一条扩增曲线（图9～图11中红色曲线）。

图1～图7 RT-PCR基因突变扩增曲线，图中S型曲线为驱动基因突变。图1 EGFR18外显子G719A/C/S伴21外显子L861Q突变。图2 EGFR20外显子插入突变。图3 KRAS外显子2突变。图4 NRAS外显子3突变。图5 BRAF突变。图6 PIK3CA突变。图7 HER突变。图8 突变阴性病例。图9～图11 ALK、ROS1、RET融合基因扩增曲线。图12 融合阴性病例。

EGFR、KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA、HER2、ALK、ROS1 和RET 总体的突变阳性率分别为51.11% 、7.94% 、0.16% 、0.63% 、0.48% 、3.49% 、3.49%、1.11%和1.75%。标本整体的突变阳性率为63.49%（400/630），融合阳性率为6.35%（40/630），全部野生型的病例占30.16%（190/630）。

罕见驱动基因改变占全部驱动基因改变的27.27%（120/440）。322 例EGFR 基因突变病例中出现常见敏感突变L858R 和19-del 共293 例（90.99%），G719X 或S768I 或L861Q 突变的病例18 例（5.59%），20-ins 突变12 例（3.73%） 以及T790M 突变1 例（0.31%，伴有L858R）。EGFR 罕见突变位点占9.63%（31/322）。

2.2 驱动基因共突变情况

L858R 与S768I、L858R 与T790M 共突变各1 例。EGFR 敏感性突变伴PIK3CA 突变2 例，其余检测的驱动突变均未发生共突变情况。

2.3 驱动突变与临床病理特点的相关性

12 例微乳头为主型肺腺癌全部发生了驱动基因突变——包括EGFR 突变7 例，KRAS 突变2例，NRAS 突变1 例，HER2 突变1 例，RET 融合1例。33 例黏液腺癌中，出现EGFR 19-del 突变5例（其中1 例伴PIK3CA 突变），KRAS 突变10例，ALK 融合基因8 例。14 例鳞癌中见EGFR、KRAS、PIK3CA 突变各1 例。

表1 RAS、BRAF、PIK3CA、HER2 突变与临床病理特征的相关性（n=630）

2.3.1 EGFR 基因罕见突变位点

EGFR 20-ins 突变在≤55 岁患者中的突变率（4.28%） 明显高于＞55 岁的患者（0.93%）（P＞0.05），与年龄呈负相关（r=-0.108，P ＜0.05）。G719X、S768I、L861Q 以及T790M 突变与各项临床病理信息之间的相关性不具有统计学意义（P＞0.05）。常见敏感突变（19-del 或L858R）与性别、肿瘤大小、组织学分型以及微乳头成分之间的相关性具有统计学意义（P＜0.05）。

2.3.2 RAS、BRAF、PIK3CA 与HER2 基因

表1示，HER2 基因在≤55 岁组（8.72%）、无微乳头成分组（4.37%)、女性组（4.37%）的阳性率均高于＞55 岁组（1.15%）、有微乳头成分组（1.16%） 和男性组（2.27%）。此外，全部22 例HER2 阳性病例，均发生在肿瘤最大径≤3cm 组和无淋巴结转移组。HER2 突变与患者年龄呈负相关（r=-0.191，P＜0.05）。RAS 基因突变在黏液腺癌中阳性率最高，可达30.30%（10/33），并与肿瘤大小呈正相关（r=0.159，P＜0.05），与性别及组织学分型的相关性具有统计学意义（P＜0.05）。PIK3CA与组织学分型之间的相关性具有统计学意义（P＜0.05）。

2.3.3 ALK、ROS1、RET 融合基因

表2示，ALK、ROS1、RET 基因融合均与组织学包含微乳头成分呈正相关（r=0.097、0.105、0.136，P＜0.05）。ALK 基因融合与组织学分型的相关性具有统计学意义（P＜0.05），并与淋巴结转移呈正相关（r=0.222，P＜0.05）。在实体为主型腺癌和黏液腺癌中的突变率分别为14.63%（6/41）和24.24%（8/33），二者的突变病例数占总突变病例数的63.64%（14/22）。

表2 ALK、ROS1、RET 融合与临床病理特征的关系（n=630）

3 讨论

3.1 罕见基因突变的临床意义

EGFR 是非小细胞肺癌最为常见的基因突变类型，除19 外显子缺失及21 外显子L858R 突变是常见的敏感性突变[4]之外，还存在一些罕见突变类型，如G719X、S768I、L861Q 等敏感性突变，以及T790M、20 外显子插入突变等与耐药相关的突变[5]。罕见突变常常与其他敏感突变发生双突变，这部分患者在接受靶向治疗后可能疗效低于单突变的患者[6]。

HER2 基因在非小细胞肺癌中的改变方式包括扩增、过表达以及突变。HER2 突变率为1.92%，在女性、未吸烟患者中常见[7]。有文献报道HER2 突变的患者更容易从化疗中获益[8]。KRAS基因在白种人中突变率更高，在中国的突变率为5.9%～8.0%[9]。KRAS 通常与EGFR、BRAF 等基因突变互斥，与ALK 等基因融合亦不共存，并在实体为主型腺癌及浸润性黏液腺癌中更为常见。PIK3CA 基因突变在肺腺癌中的阳性率为4.4%，文献报告PIK3CA 基因可以和其他驱动突变发生共突变，这与我们的实验结论一致。NRAS 基因突变较为少见，文献报道其突变率为0.29%[10]，其临床意义尚待探讨。BRAF 基因在肺腺癌中的突变类型主要包括V600E、L956V、G468A 等，突变率约为4.9%，大部分突变类型为V600E 突变[11]。BRAF 抑制剂维莫非尼对BRAF V600E 突变的患者有一定的治疗效果[12]。

3.2 ALK、ROS1、RET 基因融合的检测意义

用于检测基因融合的方法包括RT-PCR、荧光原位杂交、免疫组织化学和测序等，在临床上以前两者最为常见。ALK 基因融合常发生在实体型、腺泡型腺癌伴细胞内黏液的病理组织分型之中，突变率为6.6%～9.6%[13]。虽然ALK 融合的阳性率较低，但患者应用靶向药物之后的客观有效率明显高于化疗。ALK 基因融合一般与EGFR 等基因发生共突变的概率极低，但亦有文献报道这2 个驱动基因可以同时发生突变[14]。与ALK 相似，ROS1 基因融合多见于女性不吸烟的肺腺癌患者，亦不与EGFR、KRAS、ALK 等驱动突变发生共存，其在人群中的总体发生率约为1%～2%[15]，目前针对ROS1 融合的靶向药物包括克唑替尼以及卡博替尼等[16]。此外，ALK 与ROS1 基因融合都更容易出现在浸润性黏液腺癌中。RET 基因融合发生率为1%～2%，NCCN 指南推荐使用卡博替尼来治疗RET 融合的患者[16]。