醋酸棉酚在鲤不同器官和组织中的残留量及对转氨酶和CYP3A、sod、cat 和gpx 基因表达的影响

张静，张孟丹，梁俊平，许振山，王先锋，郭文丽，张建新，李慧

（河南师范大学水产学院，河南省水产动物养殖工程技术研究中心，河南 新乡 453007）

我国是水产养殖大国，2018 年淡水鱼类养殖总产量达2544.28 万t，其中鲤Cyprinus carpio 产量达296.22 万t[1]。鲤养殖产业的规模化发展，对饲料的需求量越来越大，而鱼粉等蛋白饲料资源日益缺乏且价格昂贵，因此，寻求适宜的植物替代蛋白已成为解决水产养殖业可持续发展的重要途径之一[2]。

棉粕来源广、产量高、价格低廉、蛋白含量丰富，已成为水产饲料中的重要蛋白来源之一。然而，棉粕赖氨酸水平较低，且含有游离棉酚，特别是棉酚过量蓄积会引起水产动物生长受阻，肝、肾等组织病变[3-5]，限制了棉粕的广泛应用[6-9]。研究发现，在基础日粮中添加300～900 mg/kg 醋酸棉酚，投喂8周后，异育银鲫Carassius auratus gibelio 的增重率、特定生长率随着醋酸棉酚添加量的增加而下降；添加900 mg/kg 醋酸棉酚组异育银鲫肥满度、肝脏指数、血清碱性磷酸酶活力显著下降，血清转氨酶活力显著升高，而添加300 mg/kg 醋酸棉酚组，其肝脏指数和血清生化指标与对照组无显著差异[3]。在饲料中添加1200 mg/kg 醋酸棉酚，经过8 周的投喂，会引起奥尼罗非鱼（Oreochromis niloticus× O.aureus）增重率、饲料利用率下降，血清谷丙转氨酶活力升高；当添加量低于600mg/kg 时，对罗非鱼的生长性能及血清生化指标无明显影响[4]。鲤摄食含游离棉酚647mg/kg 的饲料8 周后，增重率、饲料转化率显著下降，血清转氨酶活力、羟基自由基含量升高；当饲料中游离棉酚含量低于215.7mg/kg 时，对上述指标无显著影响[5]。由此可见，在一定剂量范围内，水产动物对游离棉酚具有一定的耐受性。但是，水产动物解游离棉酚毒、降低其损伤的机理，目前仍无深入研究。

《GB 13078-2017 饲料卫生标准》规定：杂食性水产动物饲料中游离棉酚含量低于300 mg/kg，按照每日摄食量3%左右计算，日摄食游离棉酚约为10mg/kg 体质量。本研究通过给鲤单次口灌10 mg/kg体质量剂量的醋酸棉酚，分析鲤体内醋酸棉酚含量变化与血清转氨酶、药物代谢酶CYP3A、抗氧化酶sod、cat、gpx 基因表达间的关系，以期为揭示鱼类解毒游离棉酚的机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

实验用鲤购于郑州市中牟县某养殖场，平均体质量（55±2.5）g，在室内循环水养殖系统暂养2 周。暂养期间，自然光照，水温控制在23℃左右，每周清洗滤网3 次，换水一次，换水量为养殖水体的1/3，每天按鱼体质量的3%，在9:00、12:00 和18:00 投喂基础饲料，正式实验前停食24 h。

谷丙转氨酶（Glutamic-pyruvic transaminase，GPT）、谷草转氨酶（Glutamic-oxalacetic transaminase，GOT）试剂盒购于南京建成生物工程研究所。荧光定量试剂盒购于TaKaRa 生物技术有限公司。醋酸棉酚（纯度＞97.5%）购于大连美仑生物技术有限公司。氯化钠（分析纯）购于国药集团化学试剂有限公司。

醋酸棉酚悬浊液配制：准确称取0.056 g 醋酸棉酚，用0.65%的无菌生理盐水定容至10 mL，超声助溶，配制成浓度为5.5 mg/mL 的醋酸棉酚悬浊液。

1.2 方法

1.2.1 实验分组、给药及取样

实验分为对照组和棉酚组2 组。棉酚组，每尾鱼用1mL 无菌注射器（弃掉针头） 吸取0.1mL 5.5mg/mL 醋酸棉酚悬浊液（剂量相当于10mg/kg 鱼体质量）灌入鲤前肠，对照组以同样方式给每尾鱼灌入0.1mL 0.65%的无菌生理盐水，分别于给药后1h、4h、12h、24h、48h 和72h 尾静脉采血，采得的血液室温静置3h，5000r/min 离心15min，收集血清后-80℃冷冻保存；同时解剖取肝胰脏、前肠、中肠、胆囊。每个时间点取7 尾鱼，各组织于液氮速冻后-80℃冷冻保存，用于醋酸棉酚含量及基因表达分析。

1.2.2 醋酸棉酚含量的测定

（1）样品预处理

血清、胆汁处理：血清、胆汁样品于室温下自然解冻，混匀后，每个血清样品吸取500 μL，每个胆汁样品吸取100μL 至10mL 离心管，加入3mL 丙酮，涡旋30s，室温避光静置2h，4500r/min 离心15min，移上清至10mL 玻璃离心管，吹氮气使丙酮挥发，加入70%丙酮-磷酸溶液使残留物充分溶解，0.22μm有机滤膜过滤后-20℃保存，用于检测醋酸棉酚的含量。

组织处理：将组织样本液氮研磨混匀后，准确称取一定的量（肝胰脏0.5g、前肠0.25g、中肠0.4g）于10mL 离心管中，先加入1mL 丙酮，12000r/min 匀浆10s，再加2mL 丙酮清洗刀头2 次，合并3 次液体于离心管中，涡旋30s，室温避光静置2h，4500r/min离心15min，移上清至10 mL 玻璃离心管，吹氮气、残留物溶解和有机滤膜过滤及保存同上。

（2）标准曲线

准确称取0.0102 g 醋酸棉酚，溶于70%丙酮-磷酸溶液，定容至100mL，超声波超声30 min 使其完全溶解，即为100μg/mL 的棉酚标准品储备液，再用70%丙酮-磷酸溶液将其依次稀释为100μg/mL、50μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL 和1μg/mL 的棉酚标准品工作液，分别加入盛有一定量空白组织的10mL 离心管中，每个浓度设5 个重复，使醋酸棉酚标准品与空白组织充分混合，室温静置2h 后按照组织样品的处理方法进行前处理。HPLC 检测各浓度标准品的峰面积，以标准品浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标做标准曲线，得出回归方程和相关系数。

（3）检测条件

高效液相色谱仪：Agilent 1260；

色谱柱：Agilent Tc-C18，250 mm×5 μm，5μm

检测波长：235 nm；

柱温：40℃；

流动相：血清为88%甲醇-12%磷酸溶液，肝胰脏、肠道、胆汁为85%甲醇-15%磷酸溶液；

流速：1 mL/min；

进样量：血清、肝胰脏、胆汁为10μL，前肠、中肠为20μL。

1.2.3 血清转氨酶活力的测定

血清样品室温自然解冻、混匀后，按照说明书将各试剂及样品加入96 孔板，用酶标仪检测各孔OD，代入公式计算各样品酶活力，结果以平均值±标准差（x±SD）表示。

1.2.4 基因表达量检测

根据Trizol 法提取肝胰脏、肠道总RNA，通过琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 2000 检测RNA 样品的质量和浓度。利用TaKaRa 公司的PrimeScriptRT 反转录试剂盒合成cDNA 第一链。采用Primer 5设计引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成（表1）。

将合成的cDNA 稀释后作为模板，采用TB GreenⅡ染料法，用Light Cycler 96 荧光定量PCR 仪进行扩增和数据分析。按TaKaRa SYBRPrimeScript TM RT-PCR Kit（Perfect Real Time）试剂盒说明书进行PCR 反应，反应条件为：95℃30 s；95℃5 s，60℃20 s，40 个循环。采用2-ΔΔCT法计算各基因相对表达量，结果以平均值±标准差（x±SD）表示。

1.3 数据分析

运用统计学软件SPSS 22.0 进行单因素方差分析（ANOVA），P＜0.05 为差异性显著。

2 结果与分析

2.1 醋酸棉酚在鲤血清、肝胰脏、肠道内的浓度变化

表1 本实验所用的特异性引物Tab.1 The primers used in this study

如图1 所示，以10mg/kg 鱼体质量剂量给鲤单次口灌醋酸棉酚后，鲤血清中醋酸棉酚的浓度随口灌时间的延长呈先上升后下降的趋势，在4h 上升到最大值5.47μg/mL（P＜0.05），24h 下降至1.74μg/mL，72h 达到最低为0.50μg/mL（P＜0.05）。

如图2 所示，醋酸棉酚在前肠中的浓度随口灌时间的延长而下降，1h 达到最大值23.16μg/g（P＜0.05），72h 降至0μg/g；醋酸棉酚在中肠中的浓度随口灌时间的延长，呈波浪式先上升后下降的趋势，其浓度在口灌后24h 达到最大值22.11μg/g（P＜0.05），72h 降至0.34μg/g；醋酸棉酚在肝胰脏中的浓度随口灌时间的延长呈波浪式下降趋势，在口灌后1h 即达到最高浓度21.31μg/g（P＜0.05），72h 降至2.02μg/g；醋酸棉酚在胆汁中的浓度随口灌时间的延长呈波浪式下降，口灌后1h 达到峰值为12.54 μg/mL（P＜0.05），72h 降至3.19μg/mL。

2.2 醋酸棉酚对鲤血清谷草转氨酶、谷丙转氨酶活力的影响

如图3、图4 所示，单次口灌10mg/kg 醋酸棉酚后的1h、4h、12h、24h、48h 和72h，鲤血清GPT 活力均显著低于对照组（P＜0.05），血清GOT 除12h 以外，其余时间点均低于对照组，其中在1h、4h、48h 显著低于对照组（P＜0.05）。

2.3 醋酸棉酚对鲤肝胰脏、肠道CYP3A 相对表达量的影响

如图5～7 所示，给鲤单次口灌10mg/kg 剂量醋酸棉酚后，肝胰脏CYP3A 的相对表达量在1～72 h显著高于对照组（P＜0.05），12h 上升至最大值，为对照组的4.71 倍，随口灌时间的延长，CYP3A 的相对表达量逐渐下降，在72h 下降到最小值，为对照组的1.29 倍。前肠CYP3A 的表达量在口灌后的1h、4h、12h、24h 和72h 显著高于对照组（P＜0.05），随口灌时间的延长，基本呈上升趋势，在口灌后72h 上升至最大值，为对照组的7.61 倍。中肠CYP3A 的表达量在口灌后的1～72h 均显著高于对照组（P＜0.05），且随口灌时间的延长呈先上升后下降的趋势，在12h上升至最大值，为对照组的5.03 倍，之后逐渐下降。

2.4 醋酸棉酚对鲤肝胰脏sod、cat、gpx 基因相对表达量的影响

2.4.1 醋酸棉酚对鲤肝胰脏sod 基因相对表达量的影响

如图8 所示，给鲤单次口灌10mg/kg 剂量的醋酸棉酚后，肝胰脏sod 基因表达量随口灌时间的延长，呈先上升后下降的趋势，在24h 升到最大值，为对照组的1.47 倍；与对照组相比，鲤胰肝sod 基因表达量在口灌后的1 h、4 h、12 h、24 h、48 h、72 h 显著高于对照组（P＜0.05）。

2.4.2 醋酸棉酚对鲤肝胰脏gpx 相对表达量的影响

由图9 可知，鲤肝胰脏gpx 基因表达量随口灌时间的延长呈先上升后趋于平稳的趋势，在口灌后1h 显著低于对照组（P＜0.05），在口灌后4h 与对照组无显著性差异（P＞0.05），在口灌后的12～72h 显著高于对照组（P＜0.05），分别为对照组的1.24、1.24、1.18、1.11 倍。

2.4.3 醋酸棉酚对鲤肝胰脏cat 基因相对表达量的影响

由图10 可知，鲤肝胰脏cat 基因表达量随口灌时间的延长呈先上升再下降的趋势，24h 时升至最大值，为对照组的2.01 倍；1h 时与对照组无显著差异（P＞0.05），4～72h 显著高于对照组（P＜0.05）。

3 讨论

3.1 醋酸棉酚在鲤血清、肝胰脏、肠道和胆汁内的含量变化

薛社普等[10]用C14标记法研究发现：醋酸棉酚在大鼠体内经肠道吸收后，主要通过胆汁、粪便排出体外。刘红明[11]研究表明：棉酚在大鼠肠道中吸收后，在肝脏中主要通过葡萄糖醛酸化途径代谢，后经胆汁、粪便排泄。本研究发现，给鲤单次口灌醋酸棉酚后，血清中醋酸棉酚在4h 达到峰值，而前肠、肝胰脏内醋酸棉酚浓度在1h 就达到峰值，说明醋酸棉酚首先在前肠吸收后，通过门静脉进入肝脏，之后进入血液循环[11]。而棉酚溶液在肠内随着肠道蠕动向后迁移[12]，中肠内醋酸棉酚在24h 才达到峰值。胆汁中醋酸棉酚浓度随着时间变化有所降低，但在4h 后一直高于血液中浓度，推测经胆汁排泄可能是鲤排泄棉酚的重要途径之一。而经胆汁排泄到肠道内的棉酚再次经过肠道吸收而进入肝脏，所以在24h 时肝脏中醋酸棉酚又有所升高。可见，醋酸棉酚在鲤吸收、排泄中存在“肝肠循环”现象。

3.2 醋酸棉酚对鲤血清转氨酶活力的影响

动物长期摄食含有游离棉酚的饲料后，游离棉酚主要蓄积在肝脏，当蓄积量超过机体的耐受范围时，便会影响肝功能[3，5]。GPT 和GOT 是一类广泛分布于动物肝细胞线粒体中的氨基转移酶，正常情况下，在血清中活力较低，当肝脏发生病变、功能受损时，肝细胞内的GPT 和GOT 会释放渗入血液，导致血清中这两种酶活力上升，因此，其活性升高是反映肝功能受损的重要指标[5，13]。在基础饲料中添加300mg/kg 醋酸棉酚投喂异育银鲫8 周后，血清GPT和GOT 活力无明显变化，当基础饲料中添加900mg/kg 醋酸棉酚时，会引起异育银鲫血清GPT、GOT 活力显著升高[3]；在鲤饲料中添加323mg/kg 游离棉酚投喂8 周后，对血清GOT、GPT 活力无显著影响，当游离棉酚添加量超过431mg/kg 后，会引起鲤血清转氨酶活力显著升高（P＜0.05）[5]。在基础饲料中添加不同比例的刺五加、枸杞子、金银花和黄芪配伍的复方中草药饲喂42d 后，镜鲤血清GOT、GPT 活力显著下降，认为复方中草药在一定程度上起了保护肝脏的作用[14]。本研究结果显示，鲤单次口灌10mg/kg 醋酸棉酚后，血清GPT 和GOT 并未升高，却在一定程度降低了。这可能是在低剂量条件下，醋酸棉酚激活了体内解毒酶活性，将醋酸棉酚代谢成为毒性更小的物质，减弱了对肝脏的损伤作用。有研究发现，醋酸棉酚可保护大鼠糖尿病引起的肾脏、肝脏损伤[15，16]。低剂量醋酸棉酚对鲤肝脏是否也有一定保护作用，需进一步研究证实。

3.3 醋酸棉酚对鲤肝胰脏、肠道CYP3A 表达量的影响

CYP3A 是一种重要的药物代谢酶，在P450 酶家族中占30%～40%，主要分布在肝脏和肠道内，参与人体内约60%的药物代谢，在药物、毒物代谢过程中发挥重要作用[17-20]。给异育银鲫注射25～100 mg/kg 鱼体质量剂量的黄连素，抑制了CYP3A 基因的mRNA 表达及标志酶ERND 的活性，并呈剂量依赖效应，当黄连素与CYP3A 代谢的其他药物联合用药时，能提高其他药物的疗效，减少其用量[21]。将鲫暴露于0.165mg/L 和0.330 mg/L 有机磷农药辛硫磷溶液中96 h 后，鲫肝脏CYP3A mRNA 表达及酶活力均显著低于对照组（P＜0.05）[22]；将白鲢Hypophthalmicthys molitlis 暴露于0.017mg/L 和0.103mg/L杀虫剂毒死蜱溶液中24h 后，与对照组相比，白鲢CYP3A mRNA 表达量显著下调（P＜0.05）[23]；给大菱鲆Scophthalmus maximus 连续口灌50mg/kg、100mg/kg和200mg/kg 鱼体质量剂量的磺胺二甲嘧啶5d 后，各处理组CYP3A 基因的相对表达量在口灌后的1～9d 均发生不同程度的上调，其中200 mg/kg 磺胺二甲嘧啶组CYP3A 基因的相对表达量在各时间点均显著高于对照组（P＜0.05）[24]；将鲤暴露于0mg/kg、50mg/kg、100mg/kg 的利福平溶液中，8～24h 时，随着利福平浓度及暴露时间的增加，各处理组鲤肝胰脏CYP3A 基因的相对表达量呈上升趋势，且显著高于对照组（P＜0.05）[18]。由此可见，不同毒物或药物进入动物机体后对CYP3A 基因表达的影响不同。本研究发现，按照体质量给鲤单次口灌10mg/kg 剂量的醋酸棉酚，在口灌后的1～72h，肝胰脏、中肠CYP3A基因的相对表达量显著高于对照组（P＜0.05）。推测鲤CYP3A 在醋酸棉酚代谢中起到了重要作用，促进了其在体内消除速率，使血清、肝、肠道内的醋酸棉酚含量降低。

3.4 醋酸棉酚对鲤肝胰脏抗氧化酶sod、cat、gpx 表达量的影响

细胞色素P450 酶家族在催化毒物、药物代谢过程中会产生大量自由基[25]，棉酚自身也会引起动物机体产生大量自由基[26]。自由基在机体内过量累积，会导致机体产生氧化应激，破坏生物膜结构，损害蛋白质、核酸等生物大分子[27]。为防止氧自由基对机体的损伤，生物体内形成了一套抗氧化防御系统以清除自由基，主要包括抗氧化酶SOD、CAT、GSH-px 等[28]。本研究发现，给鲤单次口灌10mg/kg剂量的醋酸棉酚，鲤肝胰脏sod 表达量在1～72h 内显著高于对照组（P＜0.05），gpx、cat 表达量除1h 以外，其他时间点均高于对照组。结果说明，低剂量醋酸棉酚诱导了肝脏抗氧化酶基因表达，抗氧化酶对自由基的消除速率加快，减轻了机体的损伤。