HPLC-MS/MS测定豆类及其制品中的赭曲霉毒素A含量

2020-09-07葛晓晓彭雪琦江苏省理化测试中心

食品安全导刊 2020年21期

□ 葛晓晓彭雪琦江苏省理化测试中心

赭曲霉毒素（ochratoxin）是一种天然存在的毒性污染物质，有A、B、C与D 4种，其中赭曲霉毒素A（ochratoxin A,简称OTA）毒性最大[1]。赭曲霉毒素广泛存在于粮食、豆类、咖啡豆和饲料等，在存储及运输方式不当时，食品发生霉变可产生。OTA对动物及人类的免疫系统有显著性的破坏作用，对动物及人类肾脏、肝脏等具有致癌、致畸等作用[2—3]，所以食品中OTA含量检测至关重要。

目前，我国对于豆类及其制品中赭曲霉毒素A的定量检测方法主要包括液相色谱（HPLC）[4]和液相色谱串联质谱（LC—MS/MS）法[5]。HPLC 法采用荧光检测器检测，准确性高。LC—MS/MS法具有更高的灵敏度和高效性，但实验前处理方法对检测结果的干扰较大。常用的净化方法有免疫亲和柱净化[6]、离子交换固相萃取柱净化[7]、酶联免疫吸附法[8]等。此外，目前文献中对于豆类及其制品中赭曲霉毒素A测定技术的研究较少。本研究基于LC—MS/MS检测技术，在现有检测方法基础上对豆类及其制品的赭曲霉毒素A提取及测定方法进行优化，研究成果可为实验室检测赭曲霉毒素A提供可靠依据。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Agilent1290—6470 液相色谱 —三重四级杆串联质谱仪（美国，安捷伦公司）；BAS224S—CW万分之一天平（赛多利斯）；KQ—400KDE高功率数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；TGL—18高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；RE—2000B旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；SHB—IIIA循环水式多用真空泵（上海豫康科教仪器设备有限公司）；AutoVapS60氮吹浓缩仪（美国ATR）。

赭曲霉毒素 A 标准品（10 μg/L，Pribolab Pte Ltd），氯化钠，甲醇（AR级，国药集团）；甲醇，乙腈，甲酸（HPLC级，美国Honeywell公司）；免疫亲和柱（Romer Labs）。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 液相色谱条件

色谱柱Waters Sunfire C18（100 mm×2.1 mm，3.5 μm）；色谱柱温度40 ℃；进样量 20 μL。流动相 A 为0.1%甲酸，流动相B为乙腈，梯度洗脱：0～0.20 min（80% A+20% B），0.20 ～ 0.50 min（30%A+70%B），0.80 ～ 0.90 min（80%A+20%B），0.90～2.50 min（80%A+20%B），流速0.5 mL/min。

1.2.2 质谱条件

质谱扫描采集方法MRM，质谱离子源为ESI电离源，采用正离子模式，其他质谱条件如表1所示。

表1 质谱参数

1.3 实验方法

1.3.1 样品前处理方法

样品粉碎，过筛，称取25 g（精确到0.001 g）于100 mL容量瓶中，加入5 g氯化钠，加入60%乙腈溶液稀释定容，超声20 min，取部分溶液过滤，离心，取上清液。精密量取滤液10 mL于离心管中，加入40 mL水混匀，取10 mL过0.22 μm滤膜过免疫亲和柱，用5 mL甲醇洗脱，氮气吹干，加入1 mL甲醇溶解，待测。

1.3.2 标准曲线配制

溶剂标准溶液：准确移取赭曲霉毒素A标准溶液1 mL于10 mL容量瓶，稀释定容。分别移取5、10、20、50、100 μL 与 200 μL，于 6 个10 mL容量瓶，用甲醇溶液稀释定容，配制成浓度为0.5、1、2、5、10 μg/L和20 μg/L的系列标准溶液，待测。

2 结果与讨论

2.1 前处理优化

本次检测参考GB 5009.96—2016，对萃取溶剂进行了优化，研究了甲醇、乙腈、80%甲醇、80%乙腈、60%乙腈的提取效果。结果表明，加入少量水有助于回收率的提高，但水过多，会使提取过程中混入更多植物蛋白等水溶性物质。因此结合文献[9]及标准[10]，后续试验选择60%乙腈为提取溶剂。

2.2 色谱条件优化

试验考察了Waters Sunf i re C18（100 mm×2.1 mm，3.5 μm），Agilent Poroshell 120 EC—C18（50 mm×3.0 mm，2.7 μm）两种不同色谱柱对赭曲霉毒素A的测定效果。结果表明，在同等条件下，采用C18短柱，响应值更高，所以采用C18短柱。试验分别采用甲醇—水，乙腈—水作为流动相，发现赭曲霉毒素A峰形较宽。由于赭曲霉毒素 A 含有氨基（—NH2）及氯（—Cl），所以在水相中加入0.1%甲酸，可促进离子化效应，以提高响应。采用1%甲酸—甲醇作为流动相时，甲醇出峰时间更早，不利于杂质与目标物质的分离。所以试验采用0.1%甲酸水—乙腈作为流动相，分离效果好。

2.3 方法学研究

取阴性空白样，按相同前处理方法制得其空白基质溶液，配制20 μg/L的基质标准溶液，临用现配。同时用甲醇配制相同浓度的标准溶液，上机平行测定6次。实验结果显示，基质标准溶液峰面积为甲醇标准溶液峰面积的108%，说明经过前处理后，净化程度较高，基质效应影响较小。在后续试验中，可采用甲醇配制标准溶液。

试验采用甲醇配制质量浓度为0.5～20 μg/L的赭曲霉毒素A标准系列溶液。按照优化后的色谱、质谱条件依次进行测定。对质量浓度（x，μg/L）和定量离子对峰面积（y）进行线性拟合。拟合结果表明在0.5～20 μg/L范围内线性关系良好，线性方程为y=14 073.8x—902.9（R2=0.999 4）。采用标准添加法，以信噪比S/N≥10确定定量限（LOQ）为1 μg/kg，逐级稀释，以信噪比S/N≥3确定检出限（LOD）为 0.3 μg/kg。GB 2761—2017[11]规定豆类及其制品中赭曲霉毒素A的限量为5.0 μg/kg，所以定量限满足检测需求。

选择多种阴性样品进行添加回收率和精密度试验，试验随机选择了3种食品—黄豆、豆干、绿豆。添加水平分别为1、2、10 μg/kg，按本文方法进行样品前处理和测定，平行测定6次。结果见表2。由表2可见，在表中3种食品中，赭曲霉毒素A的平均回收率为85.6%～106.2%，相对标准偏差（RSD）为0.96%～3.5%，符合检测要求。