血浆cf-DNA/NETs水平对重症肺炎患者预后评估的价值

孙万里 郭朝蕾 李养军 王月 石志红

重症肺炎是常见危重疾病，治疗不及时可能发展为多器官功能不全，死亡率高，对患者病情进行预后监测具有重要临床意义[1-2]。急性生理学及慢性健康状况评分Ⅱ(acute physiology and chronic health evaluation Ⅱ，APACHE Ⅱ)是公认对危重症有较好评估价值的评分系统，在临床上应用广泛[3-4]。中性粒细胞作为病原体侵入的第一道抵御防线在多种炎性疾病中发挥重要作用[5]。NETs 是由促炎因子或病原体刺激使中性粒细胞活化后 细胞内染色质 DNA 及抗菌颗粒蛋白等物质释放到胞外所形成的网状结构[6-9],目前有关 NETs 杀菌机制研究较多，但有关 NETs 的临床研究较少。此外研究认为血浆中cf-DNA/NETs 与血液中 NETs 含量密切相关[10]，因此检测血浆中cf-DNA/NETs 可间接反映血液中 NETs 的表达水平。本研究旨在探讨血浆游离DNA/NETs(circulating free DNA/NETs，cf-DNA/NETs)水平对重症肺炎患者预后评估的价值。

资料与方法

一、一般资料

选取2018年1月到2019年6月就诊于本院的150例重症肺炎患者作为研究对象，年龄41～87岁，参考美国胸科学会和美国感染病学会2009年更新的重症肺炎诊断标准[11]：第一指标：(1)行有创机械通气；(2)感染性休克，需要血管升压类药物治疗。第二指标：(1)呼吸频率≥30次/min；(2)氧合指数≤250；(3)多肺叶浸润；(4)白细胞计数<4.0×109/L；(5)体温<36℃；(6)血小板计数<10.0×109/L；(7)意识/定向障碍；(8)血清尿素氮≥200 mg/L；(9)低血压，需要强力体液复苏。符合任一第一标准或三条及以上第二标准即可诊断为重症肺炎。纳入标准：(1)符合重症肺炎诊断标准；(2)ICU住院时间≥72 h；(3)临床资料完整者。排除标准：(1)合并严重心、肝、肾疾病者；(2)合并恶性肿瘤者；(3)合并免疫系统缺陷者。根据患者ICU住院30 d预后结局分为存活组(91例)、死亡组(59例)。本研究经医院伦理委员会批准，研究对象或家属签署知情同意书。

二、方法

1 血浆cf-DNA/NETs水平检测

进入ICU 24 h内抽取研究对象5 mL静脉血，置于EDTA抗凝管中，4℃，15000 r/min离心10 min，小心收集上层清液，置-80℃保存。检测时室温解冻血浆样本，采用PicoGreen荧光染料法检测血浆cf-DNA/NETs水平，采用MULTISKAN MK3酶标仪(美国Thermo Labsystems公司)检测荧光值并绘制标准曲线，将样本荧光值代入标准曲线计算血浆cf-DNA/NETs水平。

2 采用APACHE Ⅱ评分系统评估重症肺炎患者病情

进入ICU 24 h内研究对象均行APACHE Ⅱ评分评估病情。APACHE Ⅱ评分系统总分71分，包括3个部分：急性生理参数、慢性健康状况、年龄。分值越高，对应病情越严重。

三、统计学方法

结 果

一、存活组、死亡组一般资料比较

存活组与死亡组相比，性别、年龄、BMI差异均无统计学意义(P>0.05)，吸烟史、重症肺炎获得环境差异均有统计学意义(P<0.05)(见表1)。

表1 存活组、死亡组一般资料比较

二、存活组、死亡组APACHE Ⅱ评分比较

与存活组相比，死亡组APACHE Ⅱ评分较高(P<0.05)(见表2)。

表2 存活组、死亡组APACHE Ⅱ评分比较

三、存活组、死亡组血浆cf-DNA/NETs水平比较

与存活组相比，死亡组血浆cf-DNA/NETs水平较高(P<0.05)(见表3)。

表3 存活组、死亡组血浆cf-DNA/NETs水平比较

四、重症肺炎患者血浆cf-DNA/NETs水平与APACHE Ⅱ评分相关性分析

Spearman相关分析结果显示，重症肺炎患者血浆cf-DNA/NETs水平与APACHE Ⅱ评分呈正相关(rs=0.623，P<0.001)(见图1)。

图1 重症肺炎患者血浆cf-DNA/NETs水平、APACHE Ⅱ评分散点图

五、 影响重症肺炎患者预后的二元Logistic回归分析

以重症肺炎患者预后结局为因变量，以性别、年龄、BMI、吸烟史、获得环境、cf-DNA/NETs、APACHE Ⅱ评分为自变量进行二元Logistic回归分析，结果表明，吸烟史、医院获得性、cf-DNA/NETs、APACHE Ⅱ评分均是重症肺炎患者预后的危险因素(P<0.05)，年龄、性别、BMI与重症肺炎预后无关(P>0.05)(见表4)。

表4 影响重症肺炎预后的二元Logistic回归分析结果

讨 论

重症肺炎是由肺部持续感染引发的病症，多发生多器官功能障碍，客观、准确地评估重症肺炎患者病情对确定临床干预方案至关重要[12]。APACHE Ⅱ评分系统在临床上应用普遍，诸多研究表明，重症肺炎患者APACHE Ⅱ评分与病情严重程度呈正相关[13]，孟祥海等[14]研究发现，存活组重症肺炎患者与死亡组重症肺炎患者相比，入院24 h APACHE Ⅱ评分明显较低，入院72 h存活组APACHE Ⅱ评分呈降低趋势，死亡组呈升高趋势，APACHE Ⅱ评分系统在临床监测重症肺炎患者病情中有良好临床应用价值。本研究发现，死亡组较对照组APACHE Ⅱ评分高，对重症肺炎患者发生预后死亡有一定预测价值，是重症肺炎患者预后发生不良结局的危险因素。

王朝晖等[6]研究发现，细菌性脓毒症患者，外周血中NETs水平显著高于健康对照者，且与病情发展、引起感染的细菌类型均有关。张慧等[9]通过体外研究发现，NETs可以促进风湿关节炎患者成纤维细胞增殖，NETs水平越高，促进作用越强。利用有效生物标记物进行重症肺炎病情评估，对于提高患者生存率至关重要，NETs在肺炎进程中的作用已引起研究者的兴趣，NETs水平不同决定其缓解病情或加重病情发展[15]。陈丹等[7]研究发现，社区获得性肺炎患儿血浆NETs水平较健康体检儿童高，与病情严重程度有关，与细菌性、支原体、病毒性三种不同类型病原体无关，血浆NETs水平对儿童社区获得性肺炎有一定诊断价值，可能成为临床病情评估监测指标。Ebrahimi等[16]研究指出，社区获得性肺炎患者血清高水平NETs与临床不稳定性、住院时间延长、30天全因死亡率较高均有关。本研究发现，死亡组血浆cf-DNA/NETs水平较存活组高，提示cf-DNA/NETs与重症肺炎预后结局有关，进一步分析显示，重症肺炎患者血浆cf-DNA/NETs水平与APACHE Ⅱ评分呈正相关，可用来评估重症肺炎患者病情发展。金春芳等[8]通过体外研究从作用机制角度指出调节NETs水平或许有助于肺炎病情减轻，研究表明肺炎链球菌能够刺激小鼠骨髓中性粒细胞形成NETs，可以通过两种途径减少NETs聚集，一种途径是采用脱氧核糖核酸酶降解NETs，第二种途径是采用NADPH氧化酶抑制剂阻断活性氧簇生成，达到抑制NETs形成的目的，可能为调节NETs水平维持在平衡状态以促进炎症缓解提供参考依据。

分析重症肺炎预后危险因素有利于有针对性地应对，提高患者生存率。老龄是重症肺炎预后危险因素已被报道[17-18]，本研究中年龄与患者预后结局无关，可能是样本量小所致的结果偏差。吸烟史、重症肺炎获得环境、cf-DNA/NETs均影响患者预后结局，与文献报道一致[19-20]，临床可给予特别关注。

综上所述，血浆cf-DNA/NETs水平与重症肺炎患者预后结局密切相关，与APACHE Ⅱ评分呈正相关，吸烟史、医院获得性、cf-DNA/NETs、APACHE Ⅱ评分均是重症肺炎患者发生不良预后结局的危险因素，cf-DNA/NETs与重症肺炎的具体作用机制尚需进一步研究。