Hemin上调HO-1减轻急性肺损伤小鼠内质网应激及肺血管内皮功能障碍

赵爽 唐凡人 唐旭毛 徐建华

急性肺损伤(acute lung injury, ALI)在临床上常表现为急性、进行性呼吸困难，伴难治性低氧血症，其主要病理特征为以中性粒细胞肺内浸润为主的炎症反应，破坏肺血管屏障，导致富蛋白水肿液聚集，进而损害气体交换[1]。因缺乏明确有效的治疗手段，并且常合并多器官功能障碍(MODS)，最终导致ALI的病死率居高不下[2]。故而，进一步阐释ALI的发病机制并寻找可能的治疗方法依然是呼吸科及重症医学科的重要研究任务。

在生理或多种病理条件下，未折叠或错误折叠的蛋白在内质网聚集，可导致内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)，而过强的内质网应激可进一步触发炎症反应及细胞凋亡。研究表明，内质网应激参与了固有免疫反应，并可通过激活模式识别受体(PRR)促进炎症反应[3]，触发急性肺损伤[4]；并且，拮抗内质网应激可减轻肺血管内皮功能障碍及肺损伤程度[5]，提示ERS是急性肺损伤的重要发病机制。血红素氧合酶-1(HO-1)由hmox-1基因编码的血红素代谢限速酶，其在所有细胞中均有表达，且在各种刺激诱导下，通过转录因子Nrf2调节生成。HO-1可将游离血红素降解为一氧化碳, 亚铁和胆绿素，并通过调节组织对损伤的反应，在多种器官中发挥保护作用；并且其终产物之一的一氧化碳，具有与HO-1相同的抗炎、抗凋亡和抗增殖作用[6-7]。既往研究示ARDS小鼠血清、肺组织HO-1基因转录及蛋白表达水平明显升高，HO-1 诱导剂Hemin可显著抑制小鼠炎症反应及氧化应激反应，维持肺泡微血管屏障稳态，有效减轻急性肺损伤[8-10]。然而，急性肺损伤模型中，血红素诱导HO-1产生，是否可通过缓解内质网应激而改善肺血管内皮功能障碍尚不清楚。

因此，本研究旨在通过动物实验，探讨血红素对LPS所致急性肺损伤小鼠肺组织内质网应激标志蛋白和血管内皮的影响，丰富对HO-1生物学效应的认识。

资料与方法

一、 实验动物

30只SPF级雄性C57BL/6小鼠，8周龄，质量20 g～22 g，购买并饲养于重庆医科大学动物中心[重庆医科大学动物中心，合格证号: SCXK(渝)2012-0001]，予自由饮食、普通光照。本实验经伦理委员会许可，实验动物在饲养和处理中严格遵循动物伦理标准和伦理委员会相关条例要求。

二、主要试剂

脂多糖(LPS)、血红素(hemin)购自Sigma公司；蛋白提取试剂盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒、免疫蛋白印迹配胶试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自北京四正柏生物科技有限公司；电化学发光(ECL)检测试剂盒购自重庆葆光生物科技有限公司；HO-1抗体、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)抗体、C/EBP同源蛋白(CHOP)抗体、血管内皮钙粘蛋白(VE-cadherin)抗体及β-连环蛋白(β-catenin)抗体购自Abcam公司。

三、小鼠分组及给药

小鼠随机分为对照(Control)组、模型(LPS)组和治疗(H)组，每组10只。对照组：小鼠予以治疗组等量生理盐水进行腹腔注射，24 h后麻醉并处死小鼠；模型组：0.4 g·L-1水合氯醛腹腔注射，充分麻醉小鼠后固定于操作台，予留置针气管插管，将浓度为1 g·L-1的LPS溶液按照小鼠质量5 μg·g-1缓慢滴入气管，建立急性肺损伤模型，予以治疗组等量生理盐水进行腹腔注射，24 h后处死小鼠；H组：在建模后立刻按小鼠体重予100 μg·g-1血红素(质量浓度10 mg/mL)腹腔注射，24 h后处死小鼠。

四、肺组织HE染色

腹主动脉放血后暴露小鼠胸腔，取右下肺组织，生理盐水冲洗后多聚甲醛固定24 h，包埋制成5 μm石蜡切片，苏木精-伊红(HE)染色后置于光镜下观察评价肺组织变化。

五、肺组织湿/干比(W/D)值测定

处死小鼠后取左肺组织，称量肺湿重，后置于60℃烤箱烘烤至恒重，称量其干重。计算肺组织湿重与干重比值。

六、肺泡灌洗液(BALF)总细胞及多形核白细胞(PMN)计数

暴露小鼠胸腔及气管后，以1 mL 生理盐水灌注小鼠肺组织2次，回收率大于80%为合格标本，置于冰上。随后以2 000 g离心力在4℃下离心BALF 10 min。留存上清液待进一步检测；生理盐水重悬下层细胞沉淀，于血球计数板、计细胞总数，涂片后染色计PMN数。

七、BALF中蛋白浓度、IL-1β及TNF-α含量

按照BCA试剂盒说明书测定小鼠BALF上清液蛋白浓度；按照ELISA试剂盒说明书检测小鼠BALF上清液IL-1β、TNF-α水平

八、 Western blot检测肺组织各指标表达

提取小鼠右肺组织蛋白，待检蛋白测行凝胶电泳(SDS-PAGE)，湿转法转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上；封闭1 h后分别予一抗HO-1(1 ∶1000)、GRP78(1 ∶1000)、CHOP(1 ∶1000)、β-catenin(1 ∶1000)、VE-cadherin(1 ∶1000)或甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体(1 ∶2000)与PVDF膜孵育， 4℃过夜；以含0.1%吐温的三羟甲基氨基甲烷缓冲液(TBST)洗膜后加入二抗，于37℃孵育60 min； 最后，TBST洗膜3次后ECL显像并分析。

九、统计学方法

结 果

一、肺组织切片HE染色检查

组织切片示Control组小鼠肺泡腔内无出血、无富蛋白液，肺泡间隔无增厚、无炎性细胞浸润，未见明显病理改变；LPS组小鼠肺组织切片可见肺泡腔明显塌陷、缩小，肺泡间隔明显增厚伴炎症细胞浸润，偶见红细胞及富蛋白液，肺损伤评分明显增高(P<0.05)；而H组切片可见肺泡间隔轻度增厚伴中等量炎性细胞浸润，部分肺泡缩小，肺损伤评分较LPS组降低(P<0.05)(图1)。

二、肺组织湿/干比(W/D)

LPS组(4.659±1.174)肺组织W/D较Control组(2.166±0.4161)明显升高，而H组(2.885±0.6963)肺W/D较LPS组相比明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)(图2)。

图1 小鼠的肺组织HE染色(HE×200)和肺损伤评分

图2 小鼠肺组织湿/干比和肺泡灌洗液总细胞及白细胞计数

三、肺泡灌洗液(BALF)总细胞及多形核白细胞计数

LPS组BALF所含总细胞及多形核白细胞(PMN)数量较Control组明显升高，而H组BALF中总细胞及PMNs数量较LPS组明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。其中，Control组PMNs为(0.3463±0.2269)×105，LPS组PMNs为(3.257±0.6010)×105，H组PMNs为(1.763±0.8792)×105；Control组总细胞为(1.333±0.5508)×105，LPS组总细胞为(7.600±1.500)×105，H组总细胞(4.100±1.609)×105(图2)。

四、BALF中蛋白浓度、肿瘤坏死因子(TNF)-α及白介素(IL)-1β水平

LPS组BALF中蛋白浓度、TNF-α及IL-1β水平较Control组明显升高，而H组BALF中蛋白浓度、TNF-α及IL-1β水平较LPS组明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。其中，Control组蛋白浓度为(0.2220±0.1117)g/L，LPS组蛋白浓度为(1.421±0.4042)g/L，H组蛋白浓度为(0.6295±0.2266)g/L；Control组TNF-α为(29.22±8.467)pg/mL，LPS组TNF-α为(99.50±22.35)pg/mL，H组TNF-α(58.63±12.19)pg/mL；Control组IL-1β为(13.19±4.888)pg/mL，LPS组IL-1β为(51.99±14.57)pg/mL，H组IL-1β为(29.26±7.721)pg/mL(表1,图3)。

表1 BALF中蛋白浓度、肿瘤坏死因子(TNF)-α及白介素(IL)-1β水平

图3 BALF中蛋白浓度、肿瘤坏死因子(TNF)-α及白介素(IL)-1β水平

五、肺组织GRP78、CHOP及VE-cadherin、β-catenin的表达

LPS组小鼠肺组织中内质网应激标志蛋白GRP78、CHOP及HO-1表达较Control组明显升高，伴VE-cadherin、β-catenin表达明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；而H组小鼠肺组织中GRP78、CHOP较LPS组明显降低，伴VE-cadherin、β-catenin及HO-1表达明显增高，差异具有统计学意义(P<0.05)(图4)。

讨 论

急性肺损伤(ALI)于2012年归入急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，其常见肺内病因有肺炎、呼吸机相关肺损伤，肺外因素如脓毒症、胰腺炎等[1]。急性肺损伤的发病机制复杂，其核心病理生理机制为全身炎症反应综合征(SIRS)，及其所致内皮损伤、凝血功能紊乱和器官功能障碍[5,11]，遗憾的是目前并无特效救治方法[12]。随后，肺血管内皮成了急性肺损伤的研究热点之一。本研究通过气管插管滴入脂多糖(LPS)建立肺炎引起的急性肺损伤模型，探讨临床常见急性肺损伤的潜在防治方法及可能机制。

血红素氧合酶(HO)系统因其调控特性而受到广泛的研究,其广泛表达于多组织器官，主要分为诱导型血红素氧合酶-1(HO-1)和组成型血红素氧合酶-2(HO-2)；血红素氧合酶在细胞色素P450参与下可将血红蛋白氧化分解成一氧化碳(CO)、亚铁和胆绿素，是血红蛋白代谢及内源性CO合成的限速酶。其中，HO-1又称HSP32，作为应激反应蛋白酶，HO-1在正常情况下表达较低，在急性应激刺激时被诱导上调，催化血红蛋白代谢产物(尤其是CO)产生，以HO-1/CO系统协同发挥抗氧化、抗炎、抗凋亡等多种保护性生物学功能，维持细胞内环境稳定，减轻急性应激损伤对机体器官的损伤[6-7]。本研究利用肺炎所致急性肺损伤模型探讨血红素的可能作用机制，并报道了血红素上调HO-1水平，拮抗肺损伤时内质网应激的作用。组织切片结果发现，血红素干预能明显改善肺组织病理学表现，减轻肺组织中性粒细胞的浸润、减轻肺组织充血水肿并抑制肺泡间隙增厚从而拮抗肺泡塌陷、萎缩；经腹腔注射血红素后，急性肺损伤小鼠湿/干比、BALF中蛋白浓度明显降低，提示其所代表的肺血管屏障功能得以保护；最后BALF中炎症因子水平、BALF中多形核白细胞数明显降低，提示血红素降低了LPS所致的肺组织炎症水平，表明血红素诱导HO-1上调对急性肺损伤有保护作用，与国内外研究结果一致[8-10]。

图4 肺组织内质网应激指标、内皮细胞功能指标和HO-1蛋白水平

内质网应激(ER stress)的信号通路及下游效应是近年来的研究热点，其三个压力感受蛋白：1)肌醇需求酶1(inositol-requiring protein 1,IRE1)；2)双链RNA依赖蛋白激酶样ER激酶(PKR-like ER kinase, PERK)；3)活化转录因子6(activating transcription factor 6, ATF6)位于内质网膜上，在正常状况下与分子伴侣葡萄糖调节蛋白78(GRP78)结合而无活性。在应激状态下，内质网内未折叠蛋白或错误折叠蛋白增多，IRE1、PERK和ATF6分别与GRP78解离并活化，通过一系列反应后激活C/EBP同源蛋白(CHOP)及下游靶点，从而发挥下游生物学效应，如激活核转录因子-κB(nuclear factor κB, NF-κB)；并且，ER Stress还可激活半胱天冬酶(caspase)-12调控凋亡，而不依赖于线粒体或者死亡受体[13-14]。大量研究表明，内质网应激广泛参与了包括急性肺损伤在内的多种疾病的发生、发展，针对内质网应激亦是药物研发的新靶点和治疗干预的新策略[15]。本研究中，采用免疫蛋白印迹法检测内质网应激的标志蛋白GRP78和CHOP，结果显示血红素诱导HO-1上调缓解了急性肺损伤时肺组织的内质网应激；进而，检测内皮细胞功能显示H组小鼠肺组织VE-cadherin、β-catenin较LPS组表达增高，表明拮抗内质网应激并缓解内皮细胞功能障碍是血红素诱导HO-1上调对抗急性肺损伤的作用机制之一。同时，本研究具有一定局限性，因大量文献指出血红素为HO-1诱导剂，由HO-1发挥抗炎、抗氧化等保护性效应，故未设立HO-1抑制组；检测全肺总蛋白内的GRP78、CHOP无法说明内皮细胞是否存在内质网应激，但根据文献报道，内质网应激可导致血管内皮功能障碍从而加重肺损伤程度[5]，而过强的内质网应激最终触发炎症的启动和肺实质细胞的凋亡以致肺损伤。故而得出结论，LPS刺激小鼠体内包括肺血管内皮细胞在内的多种细胞发生内质网应激，共同参与急性肺损伤的进展，而血红素可通过激活HO-1，抑制内质网应激及内皮损伤，减轻肺损伤。

综上所述，血红素上调血红素加氧酶1减轻急性肺损伤小鼠内质网应激及肺血管内皮功能障碍。