MET、TXA2在非小细胞肺癌组织中的表达及临床意义

曾媛 卢孝清 张妮 夏名英

非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)是一种常见的呼吸系统恶性肿瘤，包括肺鳞癌、肺腺癌和大细胞癌[1],占肺癌患者的75%～85%，患者死亡率高达89%，居所有类型恶性肿瘤首位[1]。近年来随着放化疗、生物治疗、分子靶向治疗等治疗手段进步，NSCLC患者预后有所改善[2]，但死亡率仍处于较高水平，因此积极探究NSCLC进展、预后相关影响因子对肿瘤临床治疗仍有重要意义。有研究发现，间质表皮转化因子(Mesenchymal to epithelial transition factor，MET)在胆管癌组织中阳性表达率明显升高，与胆管癌分期和淋巴结转移有关[3]。王瑾等研究表明，甲状腺恶性结节组织中MET表达上调，联合超声检测对评估甲状腺癌患者淋巴结转移及预后价值较高[4]。有研究报道，结直肠癌患者外周血血栓素A2(Thromboxane A2，TXA2)水平升高，可能在促进肿瘤细胞增殖、转移中有重要作用[5]。Li等研究证实，TXA2在人乳腺癌肿瘤及癌前病变中均有高表达，可能是调控乳腺癌细胞生长和侵袭能力的关键因子[6]。本研究通过检测NSCLC组织中MET、TXA2 mRNA及蛋白表达水平，分析与患者临床病理特征及预后关系，探究二者在NSCLC进展中作用，为临床患者病情及预后判断提供一定理论依据。

资料与方法

一、一般资料

选取2009年6月～2014年6月本院收治的NSCLC患者82例作为研究对象，其中男性47例、女性35例，年龄(41～73)岁，平均(52.31±15.04)岁。纳入标准：①根据病理切片及TNM分期诊断标准[7]，确诊为非小细胞肺癌。②临床及随访资料完整。③患者及家属均对本研究知情，并签署知情同意书。④入组前未接受放、化疗等治疗。排除标准：①合并其他部位肿瘤。②心、肾、肝脏等重要器官严重功能障碍。③患有严重精神疾病。④孕期、哺乳期妇女。入组患者根据肿瘤分化程度分为：高中分化36例、低分化46例；根据病理类型分为：鳞癌39例、腺癌43例；根据原发肿瘤大小分为：T1～T2期64例、T3～T4期18例；根据TN分期标准可分为：Ⅰ～Ⅱ期60例、Ⅲ期22例；根据淋巴结转移情况分为：无淋巴结转移57例，有淋巴结转移25例。本研究经本院伦理委员会批准同意。

二、主要仪器和试剂

荧光定量PCR仪(型号：SLAN-965，上海宏石医疗有限公司)，RNA提取试剂盒(货号：RP2402，北京百泰克生物技术有限公司)，反转录试剂盒(货号：205311，德国Qiagen公司)，荧光定量PCR试剂盒(货号：RR820A，大连宝日医生物技术有限公司)，免疫组织化学染色试剂盒(货号：ab7310，上海艾博抗贸易有限公司)，兔抗人MET多克隆抗体(货号：ab137654，上海艾博抗贸易有限公司)羊抗兔IgG二抗(货号：A21220，深圳市安提生物科技有限公司)。

三、方法

1 样本采集

术中收集NSCLC患者癌组织及癌旁组织(距病灶>5cm)，一部分使用10%福尔马林浸泡后制成4μm厚切片，用于免疫组织化学染色；另一部分在液氮中冷冻后放入-80℃冰箱保存，用于qRT-PCR实验。

2 组织中MET、TXA2 mRNA表达水平检测

采用qRT-PCR法检测NSCLC组织中MET、TXA2 mRNA表达水平。采用Trizol法提取RNA，反转录后得到cDNA样本，使用qRT-PCR试剂盒配制20μL反应体系进行实验，反应程序如下:95℃，5min，1循环；95℃、20s，62℃、36s，70℃、20s，以上40循环，一个样品进行三次重复。采用2-ΔΔCT法计算MET、TXA2 mRNA相对表达量。

表1 qRT-PCR引物

3 组织中MET、TXA2蛋白表达水平检测

采用免疫组织化学染色法检测NSCLC组织中MET、TXA2蛋白表达水平。严格按照试剂盒说明书进行操作。所得切片在400倍显微镜下观察并采集图像资料。染色结果评分标准：细胞核、细胞质中呈棕黄色或棕褐色为MET、TXA2蛋白阳性细胞。按照阳性细胞百分比和染色强度评分：①阳性细胞百分比：<5%记0分，5%～25%记1分，>25%～50%记2分，>50%～75%记3分，>75%记4分。②阳性着色强度：无色记0分，淡黄色记1分，棕黄色记2分，棕褐色记3分。两者记分相乘为染色指数，根据染色指数分级：0～4分为低表达；5～12分为高表达。

四、随访

所有入组患者经治疗出院后以电话或复查形式对其进行5年随访，每3个月1次，期间观察并记录患者生存情况，随访至2019年6月截止，随访期间无失访患者。

五、统计学分析

结 果

一、NSCLC组织及癌旁组织中MET、TXA2 mRNA表达水平比较

NSCLC组织中MET、TXA2 mRNA表达水平明显高于癌旁组织(P<0.05)(见表2)。

表2 NSCLC组织及癌旁组织中MET、TXA2 mRNA表达水平比较

二、NSCLC组织及癌旁组织中MET、TXA2蛋白表达水平比较

如图1所示，MET、TXA2蛋白主要表达于细胞质中。NSCLC组织中MET、TXA2蛋白高表达率明显高于癌旁组织(P<0.05)(见表3)。

图1 NSCLC组织及癌旁组织中MET、TXA2蛋白表达水平比较

表3 NSCLC组织及癌旁组织中MET、TXA2蛋白表达水平比较

三、NSCLC组织中MET、TXA2蛋白表达与患者临床特征关系

NSCLC组织MET、TXA2蛋白表达水平与患者性别、年龄及吸烟与否、肿瘤病理类型比较，差异无统计学意义(P>0.05)。与肿瘤分化程度、原发肿瘤大小、TN分期、淋巴结转移比较，差异有统计学意义(P<0.05)(表4)。

表4 NSCLC组织中MET、TXA2蛋白表达与患者临床特征关系

四、NSCLC组织中MET、TXA2 mRNA表达水平相关性

NSCLC组织中MET mRNA与TXA2 mRNA表达水平呈正相关(rs=0.413，P<0.001)(见图2)。

图2 NSCLC组织中MET、TXA2 mRNA表达水平相关性

五、MET、TXA2表达水平与NSCLC患者预后关系

经Kaplan-Meier生存分析可知，MET高表达组患者5年累积生存19例，5年总生存率为37.36%；MET低表达组患者5年累积生存22例，5年总生存率为70.97%，两组比较差异有统计学意义(χ2=8.169，P<0.05)。TXA2高表达组患者5年累积生存18例，5年总生存率为33.33%；TXA2低表达组患者5年累计生存23例，5年总生存率为82.14%，两组比较差异有统计学意义(χ2=14.980，P<0.05)(见图3)。

图3 MET、TXA2表达水平与NSCLC患者预后关系

六、COX回归分析

单因素分析显示，MET、TXA2表达水平、肿瘤浸润深度、TNM分期、有无淋巴结转移、肿瘤分化程度均是影响NSCLC患者预后的危险因素。多因素分析显示，MET、TXA2表达水平和肿瘤分化程度是影响NSCLC患者预后的独立危险因素(见表5)。

表5 影响NSCLC患者预后的危险因素分析结果

讨 论

近年来，NSCLC发病率较高，且患者症状不具有典型特征，早期难以被确诊，病情易进展至中晚期，出现呼吸困难、咳嗽、咳血、转移至其它器官引起病变，严重威胁患者生存及生活质量[8]。寻找特异性标志物是控制NSCLC病情进展、提高患者生存率关键。

MET位于人类第7条染色体7q21-q31区域，主要表达于肺、肝、肾、支气管、胰腺等器官上皮细胞中，可与配体肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor，HGF)相互作用，激活磷脂酰肌醇激酶、丝裂原活化蛋白激酶等信号通路，参与调控细胞有丝分裂等生长过程[9]。Cho等研究证实，MET在小细胞肺癌中过表达，可促进癌细胞生长、侵袭和凋亡[10]。本研究结果显示，NSCLC组织中MET蛋白及mRNA表达水平明显高于癌旁组织，与Cho等[10]在小细胞肺癌中研究结果相似，提示MET表达水平升高可能与NSCLC发生有关。Zhao等研究发现，MET过表达与乳腺癌肿瘤体积大、肿瘤高分化、淋巴结转移有关[11]。本研究结果显示，NSCLC组织MET蛋白表达水平与患者性别、年龄及吸烟与否、肿瘤病理类型比较，差异无统计学意义；与肿瘤分化程度、原发肿瘤大小、TN分期、淋巴结转移比较，差异有统计学意义。

TXA2是由血小板、血管内皮细胞、中性粒细胞、星形胶质细胞等在一定条件下分泌，具有刺激血管平滑肌细胞增殖和迁移作用[12]。本研究结果显示，与癌旁组织相比，NSCLC组织中TXA2表达水平明显升高，提示TXA2水平上调可能与NSCLC发生有关。研究报道，TXA2在前列腺癌中高表达，可通过调控癌细胞染色体重构和雄激素活性，促进癌细胞增殖、侵袭和迁移[13]。本研究结果发现，NSCLC组织TXA2蛋白表达水平与患者性别、年龄及吸烟与否、肿瘤病理类型比较，差异无统计学意义(P>0.05)；与肿瘤分化程度、原发肿瘤大小、TN分期、淋巴结转移比较，差异有统计学意义，提示TXA2蛋白表达水平上调可能通过影响癌细胞增殖、侵袭、迁移水平，参与NSCLC发展。

NSCLC组织中MET与TXA2 mRNA表达水平呈正相关，提示MET和TXA2间可能存在相互作用机制，共同促进NSCLC发生发展，但具体机制尚需进一步研究。Karolina等人研究发现，血小板增多可通过分泌TXA2促进卵巢癌进展和不良预后发生[14]。Kim等研究表明，胃肿瘤原发灶和肝转移灶中MET均过表达，与患者总生存期较短、复发率增加有关，是患者不良预后标志物[15]。本研究结果显示，MET、TXA2高表达组5年总生存率明显低于MET、TXA2低表达组，提示MET、TXA2高表达可能与NSCLC生存率低等不良预后有关。单因素分析显示，MET、TXA2表达水平、肿瘤浸润深度、TNM分期、有无淋巴结转移、肿瘤分化程度均是影响NSCLC患者预后的危险因素。多因素分析显示，MET、TXA2表达水平和肿瘤分化程度是影响NSCLC患者预后的独立危险因素。提示MET、TXA2与NSCLC患者预后关系密切，可作为NSCLC患者预后的评估指标。

综上所述，与癌旁组织相比，NSCLC组织中MET、TXA2 mRNA及蛋白表达水平明显升高，可能与肿瘤分化程度、原发肿瘤大小、TN分期、淋巴结转移有关，二者相互作用，共同参与NSCLC发生、发展过程。但由于本研究样本量较少，研究方法较为单一，具体研究机制还需进一步进行实验验证探究。