HPV16、18感染与结直肠癌的相关性

左灵妮 刘 康 马晓勤

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是常见的恶性肿瘤之一，近年来的发病率和死亡率都有显著上升趋[1]。该病的发病机制尚未完全清楚，目前认为结直肠癌的发生受到多因素、多阶段、多基因变异等共同影响，是从正常黏膜-瘤-癌的演变过程，在此过程中伴随所有癌基因、抑癌基因和生长因子基因等多种基因的表达改变[2-3]。人乳头状瘤病毒(human papillomavirus，HPV)在人体中的感染率比较高，也为一种环状DNA病毒[4]。根据HPV亚型与肿瘤发生的关系可将HPV分为低中危型和高危型，高危型HPV包括HPV16、18等[5-6]。HPV16、18与宫颈癌的发生、发展密切相关，95%以上的宫颈癌组织中都可检测到HPV DNA[7]。近年来HPV与消化道肿瘤的关系也逐步得到了重视，在结直肠癌中也有一定感染率，但是具体的作用关系还不明确[8]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)具有很强的促进血管内皮细胞分裂增生的能力，可以增强毛细血管的通透，在肿瘤组织中呈现高表达状况[9]。基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMP)-9的高表达可促使肿瘤组织微血管、微淋巴管的生成，从而间接促使恶性肿瘤扩散和转移的发生[10]。本文具体探讨与分析了HPV16、18感染与结直肠癌的相关性，以明确HPV16、18的作用效果与机制。现总结报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究得到了本院伦理委员会的批准，2017年6月至2019年6月选择本院诊治的结直肠癌患者80例。纳入标准：病理学诊断为结直肠癌；临床与病理资料完整；标本采集前均未接受放疗、化疗或激素治疗；年龄20～80岁。排除标准：免疫缺陷疾病患者；临床与病理资料缺项者；妊娠或哺乳期妇女及女性育龄患者。80例患者中男性38例，女性42例；年龄最小26岁，最大78岁，平均年龄(47.49±3.39)岁；临床分期：Ⅰ期39例，Ⅱ期17例，Ⅲ期24例；组织学分化：高分化42例，中分化28例，低分化10例；病理类型：腺癌70例，鳞癌10例。

1.2 HPV16/18检测

取所有患者的病灶组织标本(病灶组)与癌旁组织标本(癌旁组)，经过无菌水漂洗处理，使用无菌眼科剪剪成约1 mm3大小，加适量0.25%胰蛋白酶置37 ℃水浴消化，消化后的悬液经200目不锈钢网过滤后移入试管，5 000 rpm/min离心5 min，弃上清液，细胞沉淀用Hanks液洗2～3次，获得单细胞悬液。采用磁珠法(硕世生物科技股份公司)提取组织总RNA，采用荧光PCR技术检测HPV16/18含量，以HPV1基因组L1区为靶区域，严格按照说明书进行操作。

1.3 免疫组化检测

兔抗人VEGF多抗购自英国Abcam公司(稀释浓度为1∶500)；鼠抗人MMP-9单抗(稀释浓度1∶200)均购自福州迈新生物技术开发有限公司；免疫组化试剂盒购自北京中杉生物技术有限公司。采用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照，已知的结直肠癌组织作为阳性对照，实验步骤按照说明书操作。VEGF、MMP-9细胞核棕褐色3分，棕黄色2分，浅黄色1分，无染色0分；阳性细胞百分比≤5%为0，>5%～25%为1，>25%～50%为2，>50%～75%为3，>75%为4；二者乘积≥4分为表达阳性。

1.4 临床调查

调查所有患者的临床资料与病理资料，对调查记录项目统一进行编码与保管。

1.5 统计方法

应用软件SPSS 20.00进行数据分析，计量数据以(均数±标准差)表示，对比为t检验；计数数据以百分比表示，对比为χ2检验，相关性分析采用Pearson相关分析，检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 HPV16、18感染率对比

病灶组的HPV16、18感染率分别为33.8%(27/80)和37.5%(30/80)，显著高于癌旁组的6.3%(5/80)和7.7%(6/80)(χ2=18.906、20.645，P均<0.05)。

2.2 VEGF、MMP-9表达阳性率对比

病灶组的VEGF、MMP-9表达阳性率为75.0%(60/80)和71.3%(57/80)，显著高于癌旁组的16.3%(13/80)和24.4%(19/80)(χ2=55.651、36.19，P均<0.05)。

2.3 HPV16、18感染率与VEGF、MMP-9表达阳性率的相关性

在病灶组织标本中，VEGF、MMP-9不同表达特征患者的HPV16、18感染率对比，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 VEGF、MMP-9不同表达特征患者的HPV16/18感染率对比(例，%)

Pearson相关分析显示病灶组织的VEGF、MMP-9表达阳性率与HPV16、18感染率都有显著相关性(P<0.05)。见表2。

表2 结直肠癌病灶组织HPV16/18感染率与VEGF、MMP-9表达阳性率的相关性(n=80)

3 讨论

随着世界人口老龄化，饮食习惯及生活方式的改变，结直肠癌在我国的发病率逐年增加。该病的病因至今尚未完全明了，不过其发病与多盐饮食、遗传、环境恶化、种族等因素有关[11]。现代研究显示结直肠癌的发生发展是一个从正常到炎性进而发展成肿瘤，同时伴有多基因改变逐渐积累的多步骤过程[12]。HPV是一类能特异感染人的皮肤和黏膜的环状DNA病毒，分子长度大约为8 Kb，包括2个蛋白编码区与1个无编码的上游调节区，由6个开放读码结构组成[13-14]。HPV具有宿主和组织特异性，是引起人上皮肿瘤的病毒，只能感染人的黏膜及上皮细胞。目前高危HPV中至少有多种型别与人类疾病关系密切，其中就包括HPV16、18[15-16]。本研究显示结直肠癌患者伴随有HPV16、18的高感染。当前也有研究显示消化道肿瘤与HPV之间存在着一定的联系，在癌标本中存在着病毒感染的超微征象与核内HPV病毒颗粒[17-18]。VEGF的高表达与血管生成、动脉粥样硬化等有显著相关性，在结直肠癌进展过程中发挥重要作用。MMP-9又称为明胶酶B，MMP-9高表达情况下可使得胶原和明胶等发生降解作用，促使肿瘤微淋巴管的新生，也可促使肿瘤细胞突破基膜导致浸润性转移发生[19]。MMP-9在结直肠癌、肝癌、结直肠癌、乳腺癌、食管癌中均呈现高表达状态，肿瘤细胞的高侵袭转移能力与MMP-9的过表达显著关联。肿瘤特异性的miRNAs表达谱对肿瘤的鉴别诊断与预后预测具有重大的意义[20]。本研究显示病灶组的VEGF、MMP-9表达阳性率为75.0%和71.3%，显著高于癌旁组的16.3%和24.4%，表明结直肠癌患者伴随有VEGF、MMP-9的高表达。

癌基因和抑癌基因功能的异常变化在结直肠癌发生与发展中发挥关键作用[21]。本研究显示在病灶组织标本中，VEGF、MMP-9不同表达特征患者的HPV16、18感染率对比差异有统计学意义；Pearson相关分析显示病灶组织的VEGF、MMP-9表达阳性率与HPV16、18感染率都有显著相关性。从机制上分析，HPV16、18感染可促使p53蛋白降解，最终引起p53诱导的细胞周期G1期阻滞减弱，也破坏了机体正常的激素分泌功能，增加了细胞的恶性转变，进而促进VEGF、MMP-9的表达[22]。本研究也有一定的不足，病例数较少，且没有纳入健康人群，可能存在一定的研究偏倚，将在下一步进行深入分析。

总之，结直肠癌患者的HPV16、18感染比较常见，也多伴随有VEGF、MMP-9的高表达，两者存在显著相关性，共同参与结直肠癌的发生与发展。